謝伯劍 鄭海紅 甘梅富

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，過(guò)去幾十年中全世界甲狀腺癌的發(fā)病率急劇增加[2-3]，特別是在我國(guó)臺(tái)州等沿海城市，每年有很多新發(fā)病例。這些新發(fā)病例大多數(shù)是甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）[4-5]，即直徑≤10mm 的甲狀腺乳頭狀癌[6]。盡管PTMC的生物學(xué)行為往往趨向良性，患者病死率較低，但臨床實(shí)踐證明，仍有部分的PTMC會(huì)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移甚至影響患者的生命[7]。V-RAF小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因突變是甲狀腺乳頭癌常見(jiàn)的基因變異形式，發(fā)生率可高達(dá)29%～88%[8-9]。研究證實(shí)，BRAFV600E的突變與PTMC的侵襲性有關(guān)，如甲狀腺腺體外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)等[7,10-12]。本文就BRAFV600E基因突變和PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進(jìn)行回顧性研究，探討B(tài)RAFV600E基因突變是否能作為PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)預(yù)測(cè)因素[13]，為PTMC的精準(zhǔn)外科干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2014年10月至2016年3月于我院行手術(shù)切除的PTMC患者的石蠟包埋標(biāo)本200例用于本研究。所有患者均符合以下要求：（1）術(shù)前均通過(guò)超聲診斷為單側(cè)腫瘤；（2）術(shù)中和術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷為PTMC；（3）行單側(cè)腺葉+峽部切除術(shù)和同側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)；（4）常規(guī)檢測(cè)腫瘤組織BRAFV600E基因突變情況。

1.2 Real-time PCR檢測(cè)BRAFV600E突變 收集符合標(biāo)準(zhǔn)的石蠟標(biāo)本，選擇蠟塊中間部分，行10μm切片，由病理科醫(yī)師確認(rèn)含腫瘤組織。以礦物油去除石蠟，離心裂解組織樣本，向離心管水相中加入20μl蛋白酶K消化組織蛋白，孵育后向離心管加入RNase A去除RNA，使用 DNA提取試劑盒（Aide Biotechnology產(chǎn)品，批號(hào)：H215091801Y）提取DNA并進(jìn)行測(cè)序。采用人BRAFV600E突變檢測(cè)試劑盒（Aide Biotechnology產(chǎn)品，批號(hào)：P215101901X）檢測(cè)BRAFV600E突變，嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)操作。陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)部質(zhì)量控制等均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。待反應(yīng)結(jié)束分析收集到的熒光信號(hào)，在陰性、陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)部質(zhì)量控制均在合適范圍的前提下，若待測(cè)基因循環(huán)閾值（Ct）＜28為BRAFV600E突變陽(yáng)性，Ct≥28則為突變陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；相關(guān)性分析采用單因素和多因素logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTMC患者的臨床病理資料 本研究共納入患者男 38 例，女 162 例，年齡 21～70（44.5±10.0）歲；腫瘤直徑 1～10（6.3±2.0）mm?；颊叩呐R床病理特征見(jiàn)表 1。

表1 PTMC患者的臨床病理特征

2.2 BRAFV600E突變與臨床病理特征的關(guān)系 BRAFV600E突變與PTMC患者臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表2。單因素和多因素分析顯示，BRAFV600E突變與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性（P＜0.05）。

表2 BRAFV600E突變與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 BRAF突變與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系BRAFV600E突變陽(yáng)性者存在中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例高于突變陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而B(niǎo)RAFV600E突變陽(yáng)性者中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)切除數(shù)量以及轉(zhuǎn)移數(shù)量與突變陰性者比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表 3。

2.4 PTMC患者BRAFV600E突變相關(guān)因素的分層分析 為進(jìn)一步了解BRAFV600E突變與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，將患者按照腫瘤大小進(jìn)行分組，在腫瘤大小不同的組內(nèi)進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，以探討不同大小腫瘤中BRAFV600E突變和中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。以腫瘤大小為分層標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行單因素分析，結(jié)果見(jiàn)表4。進(jìn)一步多因素分析顯示，腫瘤大小≤5mm的患者中，合并橋本病與BRAFV600E突變相關(guān)（OR=2.362，95%CI:1.006～5.705，P=0.036）。腫瘤大小＞5mm 的患者中，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BRAFV600E突變相關(guān)（OR=0.817，95%CI:0.451～0.907，P=0.037）。

表3 BRAF突變與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3 討論

BRAF是一個(gè)原癌基因，位于7號(hào)染色體，能夠編碼一種絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶，BRAFV600E異常激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，是該信號(hào)通路中最為關(guān)鍵的激活因子。BRAF基因點(diǎn)突變的位置在CR3區(qū)15號(hào)外顯子的1799位點(diǎn)。該位點(diǎn)發(fā)生T-A變化，導(dǎo)致密碼子600位的纈氨酸（V）被谷氨酸（E）取代，即V600E突變。這一突變使維持BRAF基因失活的P環(huán)失效，導(dǎo)致BRAF基因活化[14]。激活的BRAF繼續(xù)在MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生影響，發(fā)生級(jí)聯(lián)式激活反應(yīng)，引起細(xì)胞的異常增殖和分化，最終導(dǎo)致腫瘤的形成。大量研究已經(jīng)表明，BRAFV600E是PTC中最常見(jiàn)的遺傳事件，發(fā)生率29%～88%[8-9]，揭示BRAF基因可能與甲狀腺癌的分化增殖密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，PTMC患者中BRAFV600E的突變率為84.5%。同時(shí)有研究表明，在甲狀腺良性病變中不存在BRAFV600E突變[15]，說(shuō)明BRAFV600E突變可以作為預(yù)測(cè)甲狀腺癌的分子指標(biāo)，即如果術(shù)前發(fā)現(xiàn)有BRAFV600E突變，提示腫瘤為惡性的可能性大，需要行外科手術(shù)干預(yù)。

本研究進(jìn)一步分析了BRAFV600E同中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BRAFV600E突變之間存在相關(guān)性，BRAFV600E突變陽(yáng)性者發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例高于突變陰性者，但是BRAFV600E突變陽(yáng)性者中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃數(shù)量及轉(zhuǎn)移數(shù)量與突變陰性者并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。理論上腫瘤BRAF突變陽(yáng)性，侵襲性增強(qiáng)，向中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率增大，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的數(shù)量也應(yīng)增加，但本文并未得到這樣的結(jié)果。筆者認(rèn)為可能的原因有以下兩方面：一方面本研究選擇患者術(shù)后的標(biāo)本進(jìn)行BRAF突變檢測(cè)，因此BRAF是否突變不會(huì)影響術(shù)中的清掃決策；另一方面可能與本研究樣本量偏小有關(guān)。但BRAFV600E突變陽(yáng)性者發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例更高，由此筆者認(rèn)為BRAFV600E突變對(duì)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，因此推斷BRAFV600E基因突變狀態(tài)可作為術(shù)前預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，該結(jié)果與 Sun等[9]和 Shi等[16]的研究一致。Fraser等[17]發(fā)現(xiàn)PTC中的BRAFV600E突變預(yù)示著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺包膜外累及和無(wú)病生存率降低的風(fēng)險(xiǎn)增加。Zheng等[18]發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E突變與臨床病理結(jié)果不良密切相關(guān)，可能導(dǎo)致PTMC復(fù)發(fā)增加。即使是臨床淋巴結(jié)陰性的PTC患者，包括PTMC患者，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)也容易發(fā)生隱匿性轉(zhuǎn)移；而且隨著腫瘤體積的增大，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率也明顯增加。本研究還發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變陽(yáng)性且直徑＞5mm的PTMC更易發(fā)生中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)示該類(lèi)型的腫瘤侵襲性更強(qiáng)，該結(jié)果與Wang等[19]及Vorasubin等[20]發(fā)表的研究結(jié)果一致，提示對(duì)于懷疑甲狀腺癌的患者可以進(jìn)行術(shù)前細(xì)針穿刺活檢，并對(duì)活檢組織進(jìn)行BRAFV600E突變檢測(cè)，有利于更加精確地判斷腫瘤的良惡性。腫瘤直徑＞5mm且BRAFV600E突變陽(yáng)性的PTMC患者，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的概率更大，這可能與腫瘤體積增大，侵襲能力增加有關(guān)。腫瘤直徑＞5mm且BRAFV600E突變陽(yáng)性是相對(duì)高危的PTMC類(lèi)型，需要進(jìn)行更積極的外科手術(shù)干預(yù)[21-22]。手術(shù)時(shí)在有效保護(hù)喉返神經(jīng)和甲狀旁腺的情況下，應(yīng)常規(guī)進(jìn)行患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)，有利于進(jìn)一步明確腫瘤分期，為PTMC的個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。對(duì)于腫瘤直徑≤5mm的患者，本研究發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變狀態(tài)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，這可能是由于研究樣本數(shù)量有限有關(guān)，最終結(jié)論可尚待擴(kuò)大樣本量后進(jìn)一步驗(yàn)證。

表4 BRAFV600E突變以腫瘤大小不同分層的單因素分析

綜上所述，本研究證實(shí)BRAFV600E突變、腫瘤大小有助于預(yù)測(cè)PTMC患者的中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。對(duì)于BRAFV600E突變陽(yáng)性且腫瘤直徑＞5mm的PTMC，手術(shù)過(guò)程中建議常規(guī)行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃。本研究還存在以下不足之處：首先，本研究系回顧性分析，偏倚無(wú)法避免；其次，本研究所選的患者數(shù)量較少，時(shí)間跨度較短，缺乏有效的預(yù)后數(shù)據(jù)；最后，本文進(jìn)行分析的臨床參數(shù)項(xiàng)目有限，與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的其他可能因素未被列出。