康 嬌,薛橋麗,李 靜,楊從緒,程鎮(zhèn)朝,王 富,胡永金*
(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 學(xué)報(bào)編輯部,云南 昆明 650201)
酸菜是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品,但傳統(tǒng)自然發(fā)酵的酸菜產(chǎn)品存在不穩(wěn)定、發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、亞硝酸鹽含量高等諸多問(wèn)題,嚴(yán)重的制約著酸菜的工業(yè)化發(fā)展[1-4]。
乳酸菌(lactic acid bacteria)是泡菜發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群,對(duì)酸菜風(fēng)味的形成具有重要意義[5-7]。果蔬中的亞硝酸鹽對(duì)人體的健康有潛在影響,在低鹽泡菜發(fā)酵過(guò)程中,乳酸菌分泌的有機(jī)酸及細(xì)菌素可抑制病原菌生長(zhǎng)[8-9]。一些乳酸菌作為益生菌,對(duì)人體健康有益,如明串珠菌(Leuconostoc)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)等,特別是植物乳桿菌,很可能明顯降低泡菜中N-亞硝基二甲胺及其前體物質(zhì)(亞硝酸鹽、二甲胺、生物胺等)的含量[10-12]。
在酸菜的制作過(guò)程中加入甜米酒后,可增強(qiáng)酸菜的口感及風(fēng)味[13-14],從傳統(tǒng)優(yōu)良酸菜中分離的優(yōu)勢(shì)乳酸菌株,通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)制作出低亞硝酸鹽含量、品質(zhì)穩(wěn)定且風(fēng)味俱佳的甜米酒酸菜,為傳統(tǒng)酸菜的改造及甜米酒酸菜的加工提供一定理論和應(yīng)用依據(jù)。
1.1.1 菌種
發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)FY1、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)FY2:分離自云南富源酸菜,本實(shí)驗(yàn)室4℃斜面保存。
1.1.2 原料
青菜、甜米酒(酒精度0.5%vol)、白蘿卜、食鹽、白砂糖、紅辣椒粉、茴香粉:市售。
1.1.3 試劑
亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺(均為分析純):天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液:廣州威佳科技有限公司。
1.1.4 培養(yǎng)基
MRS液體培養(yǎng)基:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
種子培養(yǎng)基:500 g白蘿卜加入200 mL水榨汁,4層紗布過(guò)濾取濾液,濾液加入5%的蔗糖,121℃滅菌15 min,得種子培養(yǎng)基。
AE100S電子分析天平:梅特勒托利多儀器有限公司;722s分光光度計(jì):上海精密儀器儀表有限公司。
1.3.1 酸菜的工藝流程及操作要點(diǎn)
操作要點(diǎn):
清洗、晾曬:去除老葉、爛葉,清水洗凈青菜,并晾曬至失水率40%左右即可。
切碎:將處理好的青菜切為2 cm寬。
菌種活化:將FY1與FY2分別各挑取兩環(huán)至MRS液體培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)48 h后活化。
種子液:兩株乳酸菌分別按3%的接種量接入種子培養(yǎng)基,在37℃培養(yǎng)48 h得到種子液。將種子液含菌量分別調(diào)至4.0×107~5.0×107CFU/mL于4℃冷藏備用。
調(diào)味:將切好的青菜與配料(食鹽、白砂糖、甜米酒等)混合攪拌均勻。
裝瓶、發(fā)酵:將瓶子煮沸5 min進(jìn)行殺菌消毒,裝瓶時(shí)將材料壓實(shí),室溫條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵。
1.3.2 甜米酒酸菜發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)
分別考察乳酸菌添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、乳酸菌添加比例(FY1∶FY2=1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、發(fā)酵時(shí)間(3 d、6 d、9 d、12 d、15 d)、食鹽添加量(0、2%、4%、6%、8%)、白砂糖添加量(0、2%、4%、6%、8%)、甜米酒添加量(0、5%、10%、15%、20%)6個(gè)因素對(duì)甜米酒酸菜中總酸含量、亞硝酸鹽含量及感官評(píng)分的影響。
1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)
Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì),用于中心組合試驗(yàn)前挑選優(yōu)化因素。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合文獻(xiàn)[15],進(jìn)行PB設(shè)計(jì)(N=12),以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察發(fā)酵時(shí)間(A)、食鹽添加量(B)、白砂糖添加量(C)、甜米酒添加量(D)4個(gè)因素對(duì)甜米酒酸菜感官評(píng)分的影響,PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。
表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design
1.3.4 甜米酒酸菜發(fā)酵工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)
試驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì),研究食鹽添加量(X1)、白砂糖添加量(X2)、甜米酒添加量(X3)對(duì)甜米酒酸菜感官評(píng)分的影響,選取最優(yōu)配方。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平如表2。
表2 甜米酒酸菜工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology for fermentation technology optimization of pickle with sweet rice wine
1.3.5 測(cè)定方法
(1)感官評(píng)定
酸菜成熟后,請(qǐng)10名專(zhuān)業(yè)人員對(duì)甜米酒酸菜從4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)分,滿分100分,結(jié)果取平均值,感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表3。
表3 甜米酒酸菜感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standard of pickle with sweet rice wine
(2)理化指標(biāo)的測(cè)定
亞硝酸鹽含量:參照GB 5009.33—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》[17]中的方法進(jìn)行測(cè)定;總酸含量:參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[18]中酸堿滴定法測(cè)定。
總砷、無(wú)機(jī)砷、鉛、糖精鈉、山梨酸、苯甲酸、合成著色劑:根據(jù)GB/T 5009.54—2003《醬腌菜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[19]中的方法測(cè)定。
(3)微生物指標(biāo)的測(cè)定
大腸菌群、致病菌(金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌):根據(jù)GB 2714—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)醬腌菜》[20]進(jìn)行測(cè)定。
2.1.1 乳酸菌添加量對(duì)甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響
將乳酸菌添加量分別設(shè)定為1%、2%、3%、4%、5%,乳酸菌添加比例為1∶1,食鹽添加量4%,白砂糖添加量6%,甜米酒添加量10%,自然條件下發(fā)酵10 d,得到成熟的酸菜后,考察不同乳酸菌添加量對(duì)甜米酒酸菜的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 不同乳酸菌添加量對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different lactic acid bacteria addition on the quality ofpickle with sweet rice wine
由圖1可看出,隨著乳酸菌添加量的增加,甜米酒酸菜的亞硝酸鹽含量呈下降的趨勢(shì),從添加量為1%時(shí)的6.28 mg/kg降至添加量為3%時(shí)的1.52 mg/kg,之后趨于穩(wěn)定,雖然乳酸菌添加量為1%~3%時(shí)亞硝酸鹽含量有顯著性差異(P<0.05),但均低于我國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(20 mg/kg);不同乳酸菌添加量條件下甜米酒酸菜的總酸含量基本穩(wěn)定,添加量為2%時(shí)總酸含量最低,為2.12 g/100 g,添加量為5%時(shí)總酸含量最高,為3.58 g/100 g;甜米酒酸菜的感官評(píng)分隨著乳酸菌添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì),乳酸菌添加量為3%時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最高,為87.5分;因此,選擇最適乳酸菌添加量為3%。
2.1.2 乳酸菌添加比例對(duì)甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響
將乳酸菌添加比例(FY1∶FY2)分別設(shè)定為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1,乳酸菌添加量3%,其他條件同2.1.1,結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 不同乳酸菌添加比例對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different lactic acid bacteria ratio on the quality of pickle with sweet rice wine
由圖2可看出,甜米酒酸菜的亞硝酸鹽含量在FY1∶FY2為1∶2時(shí)最低為1.59 mg/kg,F(xiàn)Y1∶FY2為2∶1時(shí)亞硝酸鹽含量最高為4.22 mg/kg;不同乳酸菌添加比例條件下甜米酒酸菜的總酸含量沒(méi)有明顯變化,均處于3.02~3.32 g/100 g;甜米酒酸菜感官評(píng)分在FY1∶FY2為1∶2時(shí)最高,為88.4分,總體變化差異不顯著(P>0.05)。兩種乳酸菌混合發(fā)酵可以增加酸菜風(fēng)味,乳酸菌添加比例(FY1∶FY2)為1∶2時(shí),甜米酒酸菜的感官評(píng)分最高,亞硝酸鹽含量最低,因此,選擇最適乳酸菌添加比例(FY1∶FY2)為1∶2。
2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)甜米酒酸菜的感官及理化指標(biāo)的影響
將乳酸菌添加量設(shè)定為3%,添加比例(FY1∶FY2)為1∶2,其他條件同2.1.1,自然條件下分別發(fā)酵3 d、6 d、9 d、12 d、15 d,考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different fermentation time on the quality of pickle with sweet rice wine
由圖3可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),亞硝酸鹽含量先上升,第6天達(dá)到最高,為8.45 mg/kg,隨后顯著下降,9 d后趨于穩(wěn)定;總酸在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈緩慢上升趨勢(shì),從2.37 g/100 g增加至3.88 g/100 g,但總體變化不顯著(P>0.05);感官評(píng)分隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而上升,從第3天的65.8分顯著上升(P<0.05)至第9天的88.4分,之后雖然有些許下降但差異不顯著。發(fā)酵至第9天時(shí),亞硝酸鹽含量相對(duì)較低,感官評(píng)分最高,因此,選擇最適發(fā)酵時(shí)間為9 d。
2.1.4 食鹽添加量對(duì)甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響
將食鹽添加量分別設(shè)定為0、2%、4%、6%、8%,乳酸菌添加量3%,乳酸菌添加比例(FY1∶FY2)為1∶2,白砂糖添加量6%,甜米酒添加量10%,自然條件下發(fā)酵9 d,考察不同食鹽添加量對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。
由圖4可知,發(fā)酵過(guò)程中,小部分的鹽可能會(huì)轉(zhuǎn)化成為亞硝酸鈉而增加亞硝酸鹽的含量,隨著食鹽添加量的增加,甜米酒酸菜的亞硝酸鹽含量整體呈先上升后下降趨勢(shì),從1.13 mg/kg升至2.02 mg/kg,最后降至1.84 mg/kg,但總體變化無(wú)顯著性差異(P>0.05);總酸隨著食鹽添加量的增加緩慢增加,從3.07 g/100 g升至3.58 g/100 g,總體變化不顯著(P>0.05);感官評(píng)分隨食鹽添加量的增加急劇上升后急劇下降,最高達(dá)到85.9分;因此,選擇最適食鹽添加量為4%。
圖4 不同食鹽添加量對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different salt addition on the quality of pickle with sweet rice wine
2.1.5 白砂糖添加量對(duì)甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響
將白砂糖添加量分別設(shè)定為0、2%、4%、6%、8%,乳酸菌添加量3%,乳酸菌添加比例(FY1∶FY2)為1∶2,食鹽添加量4%,甜米酒添加量10%,自然條件下發(fā)酵9 d,考察白砂糖添加量對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。
圖5 不同白砂糖添加量對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of different sugar addition on the quality of pickle with sweet rice wine
由圖5可看出,甜米酒酸菜中的亞硝酸鹽含量及總酸含量均趨于穩(wěn)定,無(wú)顯著性差異(P>0.05);感官評(píng)分隨白砂糖添加量的增加而顯著上升(P<0.05),從60.1分上升至88.5分后顯著下降至76.2分(P<0.05),因此,選擇最適白砂糖添加量為6%。
2.1.6 甜米酒添加量對(duì)甜米酒酸菜感官及理化指標(biāo)的影響
將甜米酒添加量分別設(shè)定為0、5%、10%、15%、20%,乳酸菌添加量3%,乳酸菌添加比例(FY1∶FY2)為1∶2,食鹽添加量4%,白砂糖添加量6%,自然條件下發(fā)酵9 d,考察甜米酒添加量對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。
由圖6可看出,甜米酒酸菜的亞硝酸鹽含量及總酸含量變化無(wú)顯著性差異(P>0.05);感官評(píng)分隨著甜米酒添加量的增加而顯著上升(P<0.05),從62.3分上升至82.0分后顯著下降至78.6分(P<0.05),故選取15%為最適添加量。
圖6 不同甜米酒添加量對(duì)甜米酒酸菜品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of different sweet rice wine addition on the quality of pickle with sweet rice wine
按PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn),PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4,各因素主效應(yīng)分析試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。
表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments
表5 Plackett-Burman試驗(yàn)的效應(yīng)分析Table 5 Effect analysis of Plackett-Burman experiments
由表4、表5可知,4個(gè)因素中重要性最大的3個(gè)因素分別是食鹽添加量(B)、甜米酒添加量(D)和白砂糖添加量(C),其中食鹽添加量對(duì)感官評(píng)分影響極顯著(P<0.01),甜酒添加量、白砂糖添加量對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)。因此,選擇食鹽添加量、白砂糖添加量和甜米酒添加量作為主要影響因素進(jìn)行進(jìn)一步的響應(yīng)面分析。
2.3.1 甜米酒酸菜發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)
以感官評(píng)分(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo),選取食鹽添加量(X1)、白砂糖添加量(X2)、甜米酒添加量(X3)3個(gè)影響顯著的因素,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì),試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6,回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。
表6 甜米酒酸菜發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of response surface experiments for fermentation technology optimization of pickle with sweet rice wine
表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model
使用Design-Expert8.0.6進(jìn)行回歸擬合分析,得到二次回歸擬合方程為:
由表7可知,模型差異極顯著(P<0.01),失擬不顯著(P>0.05),說(shuō)明所得模型擬合度良好。相關(guān)系數(shù)R2=0.986 3,調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.968 6,說(shuō)明此模型能較準(zhǔn)確且真實(shí)地模擬、預(yù)測(cè)甜米酒酸菜的發(fā)酵工藝條件。
2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析與驗(yàn)證
食鹽添加量(X1)、白砂糖添加量(X2)、甜米酒添加量(X3)交互作用對(duì)甜米酒酸菜感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面及等高線如圖7所示。
圖7 食鹽添加量、白砂糖添加量、甜米酒添加量交互作用對(duì)甜米酒酸菜感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interactions between salt addition,sugar addition,sweet rice wine addition on sensory evaluation score of pickle with sweet rice wine
由圖7可知,各因素間交互作用的響應(yīng)面均呈拋物面,開(kāi)口均向下,有極大值點(diǎn);其中交互作用X1X2、X1X3的等高線呈橢圓形,對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)。
通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)分析,確定甜米酒酸菜的最適宜發(fā)酵工藝為食鹽添加量4.01%,白砂糖添加量6.23%,甜米酒添加量15.55%,感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為91.62分。為便于操作,對(duì)優(yōu)化后試驗(yàn)條件適當(dāng)調(diào)整為食鹽添加量4.0%,白砂糖添加量6.2%,甜米酒添加量15.6%;在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),感官評(píng)分為92.3分,與預(yù)測(cè)結(jié)果相近,具有參考價(jià)值。
甜米酒酸菜亞硝酸鹽含量為1.34 mg/kg,總酸含量(以乳酸計(jì))為3.23 g/100 g,總砷及無(wú)機(jī)砷、鉛、糖精鈉、山梨酸、苯甲酸、合成著色劑均未檢測(cè)出。細(xì)菌總數(shù)為5.4×105CFU/g,大腸菌群為0 MPN/g,致病菌未檢出。理化及衛(wèi)生指標(biāo)均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
通過(guò)單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)及Box-Behnken設(shè)計(jì),得出甜米酒酸菜發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件為食鹽添加量4.0%,白砂糖添加量6.2%,甜米酒添加量15.6%,在室溫條件下發(fā)酵9 d。按照優(yōu)化所得配方制作出的甜米酒酸菜成品感官評(píng)分為92.3分;清香味美,解膩開(kāi)胃,品質(zhì)穩(wěn)定,更便于工業(yè)生產(chǎn)。