張二康，王修俊，王麗芳，馮廷萃

（1.貴州大學(xué) 發(fā)酵工程與生物制藥省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣名城食品廠，貴州 黔東南州 557700）

發(fā)酵辣椒是一種頗具特色的調(diào)味品，既保留了鮮辣椒原有的色澤、脆度、辣味和形態(tài)，又具有發(fā)酵制品[1]特有的濃郁香氣[2]、風(fēng)味，同時(shí)有促進(jìn)食欲、幫助消化、抗氧化、抑菌、抗動(dòng)脈粥樣化[3]以及預(yù)防支氣管炎等功能[4]。但如今發(fā)酵辣椒產(chǎn)業(yè)受到產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定及后續(xù)保藏技術(shù)的限制，使用抽真空、熱殺菌或添加防腐劑等某一種方法單獨(dú)處理發(fā)酵辣椒時(shí)，雖然可以達(dá)到保藏的目的，但強(qiáng)度較大，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵辣椒特有的風(fēng)味及口感變差，而使用柵欄技術(shù)（hurdle technology，HT）就可以在保藏發(fā)酵辣椒的同時(shí)保證其品質(zhì)。

柵欄技術(shù)這個(gè)概念最初是由德國(guó)肉類(lèi)研究中心專(zhuān)家LEISTNER提出，是一套科學(xué)的、系統(tǒng)的將多種技術(shù)結(jié)合在一起的提高產(chǎn)品貨架期的綜合保藏方法[5]。造成食品發(fā)生腐敗變質(zhì)的重要原因是由食品中的微生物（包含腐敗菌和致病菌）的生長(zhǎng)繁殖、酶促和非酶促等生化反應(yīng)引起的，將對(duì)食品品質(zhì)有影響的柵欄因子單獨(dú)或者聯(lián)合后形成特殊的柵欄應(yīng)用到食品中，不但對(duì)微生物生長(zhǎng)起到控制作用，而且能使引起食品發(fā)生氧化變質(zhì)的酶類(lèi)物質(zhì)失活，從而防止了食品的腐敗變質(zhì)，降低了對(duì)食品的危害性，提高了食品的穩(wěn)定性和衛(wèi)生安全性，即柵欄技術(shù)。國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究多集中在肉及肉制品、水產(chǎn)品、果蔬等方面[6]，而有關(guān)柵欄技術(shù)在發(fā)酵辣椒保藏方面的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)將柵欄技術(shù)應(yīng)用到發(fā)酵辣椒的保藏中，通過(guò)控制食品保藏中的關(guān)鍵柵欄因子以及多因子的綜合控制來(lái)解決發(fā)酵辣椒的保藏問(wèn)題，同時(shí)保證其品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1.1 材料與菌種

新鮮辣椒、大蒜、生姜：市售；食鹽（食品級(jí)）：四川久大制鹽有限公司；白酒（食品級(jí)）：北京紅星股份有限公司；復(fù)合菌劑（植物乳桿菌乳桿菌屬亞種（Lactobacillus plantarum subsp.lactobacillus）R-2，植物乳桿菌片球菌屬亞種（Lactobacillus plantarum subsp.pediococcus）R-4，菌種比例為R-2∶R-4=2∶1）：貴州大學(xué)發(fā)酵工程與生物制藥省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，牛肉膏10.0 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，K2HPO42.0 g，吐溫80 1.0 mL，檸檬酸氫二銨2.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.4，固體培養(yǎng)基需加瓊脂18.0 g，121℃滅菌15～20 min。

（2）平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：酵母浸膏2.5 g，瓊脂15.0 g，胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.2，121℃滅菌15 min，滅完菌后可放于（46±1）℃恒溫水浴箱中保溫。

1.1.3 試劑

Nisin：河南安銳生物科技有限公司；脫氫乙酸鈉（食品級(jí)）：大偉生物工程有限公司；0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)溶液中心。

1.2 儀器與設(shè)備

DZ（Q）400真空（充氣）包裝機(jī)：上海兆發(fā)機(jī)械有限公司；XK97-A菌落計(jì)數(shù)器：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠；FA2004B電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；LS-1F型凈化工作臺(tái)：上海索普儀器有限公司；XFS-280A手提式蒸汽滅菌器：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SPX-250B-G型光照培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵辣椒的制作

將鮮辣椒、姜和蒜洗凈、切分、裝壇，辣椒與鹽水的比例為1∶2，鹽水濃度為4%，在發(fā)酵溫度28℃，復(fù)合發(fā)酵菌劑配比為R-2∶R-4=2∶1，接種量為4%，發(fā)酵時(shí)間48 h的發(fā)酵工藝條件下將辣椒發(fā)酵成熟后，用復(fù)合袋盛裝100 g辣椒。

1.3.2 模擬加速試驗(yàn)

通常在食品中運(yùn)用的加速方法主要有：溫度的提高、光照和濕度的增加等。本試驗(yàn)主要通過(guò)提高樣品的保藏溫度，將樣品包裝后放置于37℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從而加快樣品中的反應(yīng)速度和腐敗速度[8]。

1.3.3 單因子?xùn)艡趯?duì)發(fā)酵辣椒保藏性影響的研究

（1）真空度對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性影響的研究

分別在真空度0.04 MPa、0.06 MPa、0.08 MPa、0.09 MPa、0.092 MPa（抽真空時(shí)間分別為3 s、5 s、10 s、30 s、50 s）條件下密封發(fā)酵辣椒，在37℃保溫7 d進(jìn)行加速試驗(yàn)，加速試驗(yàn)后測(cè)定菌落總數(shù)、總酸度并結(jié)合感官確定最佳真空度。

（2）脫氫乙酸鈉對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性影響的研究[9-10]

選取脫氫乙酸鈉的添加量分別為0.005%、0.010%、0.020%、0.030%。在1.3.3確定的真空度條件下抽真空包裝，加速試驗(yàn)后測(cè)定菌落總數(shù)、總酸度并結(jié)合感官確定脫氫乙酸鈉的最適添加量。

（3）Nisin對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性影響的研究

選取Nisin添加量分別為0.005%、0.010%、0.015%、0.020%。在1.3.3確定的真空度條件下抽真空包裝，加速試驗(yàn)后測(cè)定菌落總數(shù)、總酸度并結(jié)合感官確定Nisin的最適添加量[11]。

（4）巴氏殺菌對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性影響的研究

在1.3.3確定的真空度條件下抽真空包裝后，分別在水浴70 ℃、80 ℃條件下進(jìn)行5 min、10 min、15 min、20 min的巴氏殺菌處理，加速試驗(yàn)后測(cè)定菌落總數(shù)、總酸度并結(jié)合感官來(lái)確定辣椒的最佳殺菌條件。

1.3.4 柵欄因子的正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以脫氫乙酸鈉添加量（A）、Nisin添加量（B）、殺菌溫度（C）和殺菌時(shí)間（D）柵欄因子為試驗(yàn)因素，采用L9（34）正交表對(duì)影響發(fā)酵辣椒保藏的柵欄因子進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平表見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵辣椒保藏條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for preservation conditions optimization of fermented chilli

1.3.5 測(cè)定方法

菌落總數(shù)：按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》規(guī)定的平板計(jì)數(shù)法測(cè)定[12]，試驗(yàn)結(jié)果以菌落總數(shù)（CFU/g）表示。

總酸度的測(cè)定：根據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[13]，選用pH電位法測(cè)定辣椒中總酸的含量。根據(jù)酸堿中和的原理，用標(biāo)定好的NaOH溶液滴定試樣中的酸，當(dāng)溶液的電位發(fā)生突躍時(shí)，即是滴定終點(diǎn)，以NaOH的消耗量計(jì)算出試樣中的總酸含量?？偹岫扔?jì)算公式如下：

式中：總酸度以乳酸計(jì)，g/100 g；C為已知NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V為滴定時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，mL；K為換算系數(shù)，其中乳酸的換算系數(shù)為0.09；F為試液的稀釋倍數(shù)；M為試樣的質(zhì)量，g。

感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：乳酸發(fā)酵辣椒在保藏期間的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵辣椒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of fermented chili

2 結(jié)果與分析

2.1 單因子?xùn)艡趯?duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響

2.1.1 真空度對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響

真空度對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 真空度對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響Table 3 Effect of vacuum degree on the preservability of fermented chilli

由表3可知，隨著真空度的不斷增加，氧氣含量不斷減少，菌落總數(shù)逐漸下降，這說(shuō)明在氧氣含量低的條件下，微生物的生長(zhǎng)繁殖受到一定的抑制作用，在較高真空度條件下的包裝有利于抑制樣品中微生物的生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)真空度≤0.06 MPa時(shí)，產(chǎn)品發(fā)生嚴(yán)重的褐變，真空度為0.08 MPa時(shí)發(fā)生輕微的褐變，當(dāng)真空度≥0.09 MPa時(shí)，沒(méi)有發(fā)生褐變。發(fā)生褐變的原因是在較低的真空度條件下，由于環(huán)境中的氧化還原電勢(shì)較高而使辣椒中的多酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)生褐變，抽真空能減少包裝袋中氧氣含量而降低氧化還原電勢(shì)以及減緩氧化反應(yīng)的速度，從而可以有效的防止辣椒發(fā)生褐變。由表3可知，不同的真空度對(duì)辣椒的后發(fā)酵并沒(méi)有達(dá)到有效的控制，使酸度從發(fā)酵成熟后的0.82%增加至1.2%。由于在0.09 MPa和0.092 MPa時(shí)不僅菌落總數(shù)相差不大，都在一個(gè)數(shù)量級(jí)，而且在感官評(píng)定上相差也不大，且縮短了包裝所用的時(shí)間，提高了效率，故選擇0.09 MPa的真空度進(jìn)行包裝。

2.1.2 脫氫乙酸鈉對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響

脫氫乙酸鈉添加量對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 脫氫乙酸鈉添加量對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響Table 4 Effect of sodium dehydroacetate addition on the preservability of fermented chilli

由表4可知，脫氫乙酸鈉對(duì)產(chǎn)品的后發(fā)酵有一定的控制作用，隨著添加量的增加，可以比較明顯的抑制酵母菌、霉菌、細(xì)菌等微生物的繼續(xù)發(fā)酵，但是仍不能完全有效的控制；隨著脫氫乙酸鈉添加量的增加，菌落總數(shù)呈下降的趨勢(shì)，脫氫乙酸鈉在一定程度上可以抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)脫氫乙酸鈉的添加量＞0.02%后，抑菌效果、感官評(píng)分增加不明顯，因此，選擇脫氫乙酸鈉的添加量為0.02%。

2.1.3 Nisin對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響

Nisin添加量對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 Nisin添加量對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響Table 5 Effect of nisin addition on the preservability of fermented chilli

由表5可知，結(jié)合酸度和感官可以看出，Nisin對(duì)后發(fā)酵有一定的抑制作用，隨著添加量的增加，可以比較明顯的抑制細(xì)菌等微生物的繼續(xù)發(fā)酵，但是還不能完全有效的控制；隨著Nisin添加量的增加，菌落總數(shù)呈下降的趨勢(shì)，Nisin在一定程度上可以抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖。當(dāng)Nisin的添加量＞0.015%后，抑菌效果、感官評(píng)分增加的不明顯，因此，選擇Nisin的添加量為0.015%。

2.1.4 巴氏殺菌對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響

巴氏殺菌對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，相同殺菌時(shí)間下，80℃的菌落總數(shù)均＜70℃的菌落總數(shù)，可以看出殺菌溫度越高、殺菌時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)品菌落總數(shù)越低，殺菌效果越好。其中在70℃加熱15 min后，菌落總數(shù)都沒(méi)有明顯的下降趨勢(shì)，當(dāng)在80℃處理15 min時(shí)，菌落總數(shù)下降趨勢(shì)較大，殺菌效果明顯。

表6 殺菌溫度和時(shí)間對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響Table 6 Effects of sterilization temperature and time on the preservability of fermented chilli

從酸度變化來(lái)看，在70℃和80℃條件下處理時(shí)，酸度隨殺菌的時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，但在80℃處理時(shí)酸度降低較多，對(duì)后發(fā)酵有較好的抑制，但是由于高溫和長(zhǎng)時(shí)間的處理對(duì)辣椒的風(fēng)味又有影響，導(dǎo)致80℃處理20 min時(shí)其感官評(píng)分降低，因此在能控制微生物生長(zhǎng)的同時(shí)，應(yīng)盡量降低巴氏殺菌的溫度和縮短處理的時(shí)間。綜合菌落總數(shù)、總酸度并結(jié)合感官，選擇在80℃條件下處理15 min。

2.2 多個(gè)柵欄因子的交互作用對(duì)發(fā)酵辣椒保藏性的影響

表7 發(fā)酵辣椒保藏條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal tests for preservation conditions optimization of fermented chilli

從表7和表8可以看出，以菌落總數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，最佳方案為A2B3C3D3，即脫氫乙酸鈉的添加量為0.02%，Nisin的添加量為0.02%，殺菌的溫度為85℃，殺菌時(shí)間為20 min。影響菌落總數(shù)的主次因素為C＞D＞B＞A，即殺菌溫度對(duì)菌落總數(shù)的影響最大，其次是殺菌時(shí)間和Nisin，影響最小的是脫氫乙酸鈉，其中殺菌溫度影響非常顯著，處理時(shí)間影響顯著，說(shuō)明殺菌溫度越高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，菌落數(shù)越少，對(duì)微生物的生長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)。

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal tests results

當(dāng)以感官為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，最佳方案為A2B3C1D1，即脫氫乙酸鈉的添加量為0.02%，Nisin的添加量為0.02%，殺菌溫度和時(shí)間分別為75℃和10 min，影響感官評(píng)分的主次因素為D＞C＞B＞A，即處理時(shí)間對(duì)感官的影響最大，殺菌溫度和Nisin次之，影響最小的是脫氫乙酸鈉，其中殺菌溫度和時(shí)間影響非常顯著，說(shuō)明殺菌溫度越高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)辣椒的風(fēng)味等感官指標(biāo)產(chǎn)生了比較嚴(yán)重的影響，使感官評(píng)分降低。

根據(jù)GB 5009.54—2003《醬腌菜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[14]，規(guī)定大腸桿菌≤30 MPN/100 g，本試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)大腸桿菌，而國(guó)標(biāo)并未對(duì)菌落總數(shù)做出規(guī)定，參照其他產(chǎn)品的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，一般要求菌落總數(shù)≤1×103CFU/g，由于殺菌溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)品的感官有比較嚴(yán)重的影響，所以在既能抑制微生物生長(zhǎng)和控制后發(fā)酵的同時(shí)，又能保證產(chǎn)品的感官品質(zhì)，最終將A2B3C1D1作為最佳柵欄組合，由于在正交試驗(yàn)中沒(méi)有A2B3C1D1這項(xiàng)組合，所以補(bǔ)做這組試驗(yàn)，在此條件下做了3次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值，其試驗(yàn)結(jié)果為菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值（lgCFU/g）為2.30，感官評(píng)分為95分，總酸度為0.85%。經(jīng)過(guò)該柵欄因子的組合處理后，不僅能抑制微生物的生長(zhǎng)，沒(méi)有脹袋的發(fā)生，控制產(chǎn)品的繼續(xù)發(fā)酵，而且能使產(chǎn)品保持較好的感官品質(zhì)，所以將該組合作為發(fā)酵辣椒保藏的最優(yōu)方案。

3 結(jié)論

應(yīng)用柵欄保藏技術(shù)可以很好的解決發(fā)酵辣椒的保藏問(wèn)題，既達(dá)到發(fā)酵辣椒保藏的目的，又保證了其風(fēng)味和品質(zhì)。通過(guò)對(duì)真空度、脫氫乙酸鈉的添加量、Nisin的添加量、殺菌溫度和時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以菌落總數(shù)和感官評(píng)分為指標(biāo)，利用極差和方差方法確定了辣椒保藏的優(yōu)化柵欄因子組合為添加0.02%的脫氫乙酸鈉和0.02%的Nisin，抽真空度為0.09 MPa密封后，在75℃的殺菌溫度下處理10 min，在此優(yōu)化條件下，菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值為2.30，感官評(píng)分為95分，總酸度為0.85%。經(jīng)過(guò)該柵欄因子組合處理的產(chǎn)品不僅可以抑制保藏期間微生物的生長(zhǎng)，控制產(chǎn)品的繼續(xù)發(fā)酵，而且還有利于保證辣椒的感官。