李明，陳潤，葛文雪，姚夢依，張雪蓮

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433

蛋白質(zhì)的翻譯過程分為起始、延伸、終止和核糖體再循環(huán)4個步驟，每個步驟都需要不同的蛋白質(zhì)翻譯因子參與[1-2]，如起始因子(IF1、IF2、IF3)，延伸因子(EF-Tu、EF-Ts、EF-G)及肽鏈釋放因子(RF1、RF2、RF3)。然而,在蛋白質(zhì)翻譯過程中，會因各種原因?qū)е潞颂求w滯留于mRNA，引起蛋白質(zhì)翻譯停滯，此時需要一些因子如EF4、EF-P、ArfA(YhdL)、ArfB(YaeJ)等的參與來拯救停滯的核糖體或異常延伸，從而保證蛋白質(zhì)合成的持續(xù)完成[3-6]。

EF4也被稱作LepA[7]，是一個高度保守蛋白[8-10]，存在于真核生物的線粒體、葉綠體和幾乎所有的原核生物[2]中。有意思的是，EF4在原核生物中具有高度的序列保守性[11]，卻不是一個生長必需的基因。細菌在正常生長情況下并不需要EF4作為延伸因子，但在特殊情況導(dǎo)致核糖體熄火時是否需要EF4作為延伸因子意見尚不一致。2006年Qin等[11]研究認為，EF4可通過將tRNA從E-和P-位點移動到P-和A-位點來反向轉(zhuǎn)運核糖體。動力學(xué)研究表明，EF4誘導(dǎo)的反向移位需要幾分鐘才能完成[12]。此外，Liu等研究認為，在蛋白質(zhì)翻譯的延伸階段，EF4的功能類似于EF-G，主要用于競爭性結(jié)合PRE核糖體復(fù)合物[13]，且結(jié)合速率與EF-G一致，此特征使其可減緩肽鏈合成速率，從而促進新生多肽鏈邊翻譯邊折疊。該研究結(jié)果也對EF4是否可反向轉(zhuǎn)運核糖體提出質(zhì)疑[13]。還有研究表明，真核生物中Guf1(EF4的同源物)的缺失會導(dǎo)致線粒體發(fā)生嚴重缺陷，使呼吸鏈復(fù)合體蛋白合成和活性受到嚴重影響[14]。大腸埃希菌中EF4是一個在壓力條件下發(fā)揮作用的蛋白，在不同程度的應(yīng)激反應(yīng)中表現(xiàn)為促進細胞存活或細胞死亡兩種功能[15-19]。有研究表明，鳥分枝桿菌中EF4編碼基因的突變株在巨噬細胞內(nèi)存活率下降[20]，提示EF4可能與細菌毒力相關(guān)。總之，EF4是一個比較有爭議的重要蛋白，不僅在某些特殊情況下作為延伸因子發(fā)揮作用，可能還存在其他生理功能。

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)是導(dǎo)致人類結(jié)核病的重要病原菌，致病機制十分復(fù)雜。從富氧環(huán)境到在巨噬細胞內(nèi)生存所面對的缺氧、一氧化氮殺傷、營養(yǎng)缺乏等極端生長條件，結(jié)核分枝桿菌需要調(diào)節(jié)自身去適應(yīng)，EF4可能在其中發(fā)揮重要作用。為探索EF4的功能，需要構(gòu)建EF4敲除突變株，但由于分枝桿菌體內(nèi)重組率非常低，分枝桿菌的基因敲除一直是個難題。本研究利用高滴度噬菌體特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)基因敲除方法[21]成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌H37Ra株lepA基因敲除株，為后續(xù)深入開展結(jié)核分枝桿菌的EF4功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒結(jié)核分枝桿菌H37Ra、恥垢分枝桿菌mc2155、大腸埃希菌DH5α均為本實驗室保存；大腸埃希菌HB101、溫敏型穿梭質(zhì)粒phAE159質(zhì)粒及p0004S質(zhì)粒由美國W.R. Jacobs實驗室提供。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司，PacI、Van91I、CIP堿性去磷酸化酶和T4連接酶購自NEB(北京)有限公司，MaxPlax Lambda Packaging Extract購自Epicentre公司，Middlebrook7H9/7H10購自美國BD公司，OADC [5%牛血清白蛋白購自Aamresco公司，0.03% catalase購自Sigma公司，2%葡萄糖、0.85% 氯化鈉和 0.01% 油酸購自生工生物工程(上海)股份有限公司]，Tryptone/Yeast Extract購自O(shè)xoid，BCA蛋白定量試劑盒購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司，其他常用生化試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司和國藥集團化學(xué)試劑有限公司。兔抗EF4、ICL1、EF-P多克隆抗體均由本實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 p0004S-ΔlepA質(zhì)粒的構(gòu)建以結(jié)核分枝桿菌H37Ra全基因組DNA為模板，分別設(shè)計兩對針對lepA基因的左、右臂引物，即lepA-LS(5′-TTTTTTTTCCATAAATTGGCCGAAATGGGC-GATTTTGCG-3′)、lepA-LA(5′-TTTTTTTTC-CATTTCTTGGTCGGGCGCGTCGAGGTGCCA-CAG-3′)和lepA-RS(5′-TTTTTTTTCCATAGA-TTGGTCCAGGGTATCCGCGTCGGG-3′)、lepA-RA(5′-TTTTTTTTCCATCTTTTGGGCATCGT-TAGCATCGGTGAC-3′)。通過聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增lepA基因左、右臂。反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，29個循環(huán)；72 ℃ 5 min。采用Van91Ⅰ 酶切l(wèi)epA基因左、右臂和p0004S質(zhì)粒，連接酶切后的片段，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含150 μg/mL潮霉素的LB固體平板，挑取單克隆菌落并抽提質(zhì)粒，Van91Ⅰ 酶切驗證確定陽性克隆。

1.2.2 phAE159-ΔlepA穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建PacⅠ 分別酶切p0004S-ΔlepA質(zhì)粒和phAE159質(zhì)粒，連接兩酶切后的片段，通過噬菌體體外包裝試劑盒轉(zhuǎn)化HB101感受態(tài)細胞，涂布于含150 μg/mL潮霉素的LB固體平板，挑取單克隆菌落并抽提質(zhì)粒，PacⅠ酶切驗證確定陽性克隆。

1.2.3 噬菌體擴增取2 μg phAE159-ΔlepA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌mc2155感受態(tài)細胞，加入1 mL 7H9培養(yǎng)基復(fù)蘇4 h，將復(fù)蘇的菌液與top agar混勻，鋪于LB平板上，30 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2～3 d。

挑4～5個噬菌斑到EP管中，加入200 μL MP緩沖液，4 ℃過夜。取上清液50 μL加至300 μL新鮮培養(yǎng)的mc2155菌液中，再與top agar混勻，鋪于LB平板上。待噬菌斑緊密相連，將噬菌斑刮到離心管中，加入適量MP緩沖液，4 ℃過夜，用 0.22 μm濾器過濾上清液，4 ℃保存。

將噬菌體進行10倍梯度稀釋，取各梯度噬菌體加至新鮮培養(yǎng)的mc2155菌液中，再與top agar混勻，鋪于LB平板上，培養(yǎng)2～3 d，計算噬菌斑滴度。

1.2.4lepA基因敲除菌株的構(gòu)建制備結(jié)核分枝桿菌H37Ra侵染感受態(tài)[21]，以細菌∶噬菌體=1∶10的比例混勻，避光孵育3～4 h，補加10 mL 7H9+OADC，37 ℃孵育16～20 h，離心并涂布于含75 μg/mL潮霉素的7H10+OADC平板上，37 ℃ 培養(yǎng)4～6周，挑取生長的陽性克隆。

1.2.5lepA基因敲除菌株的驗證挑選單克隆菌落置于10 mL 7H9+OADC培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)3周，抽提敲除株全基因組DNA，以lepA基因左、右臂遠端序列設(shè)計引物lepA-S(5′-GAGCAGACGC-AAAATCGCCCAAATTC-3′)和lepA-A(5′-GC-CGGTGCTCGACGGGAAGAAACTG-3′)進行PCR驗證。PCR條件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 15 s，72 ℃ 6 min，29個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的條帶并進行測序。

收集5 mL 處于對數(shù)期的野生株和敲除株菌液，超聲破碎細胞，用BCA蛋白定量試劑盒對上清液全菌蛋白進行濃度測定。取野生株和敲除株樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡檢測。

1.2.6 菌落形態(tài)及生長曲線調(diào)整野生株和敲除株密度至OD600=0.6，稀釋后涂布于7H10+OADC平板上，培養(yǎng)6周，在連續(xù)變倍體顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。將生長密度為OD600=0.6 的野生株和敲除株以1∶50比例接種到7H9+OADC培養(yǎng)基中，每隔3 d取樣測OD600，檢測生長曲線。

1.2.7 細菌生物膜收集野生株和敲除株菌液，離心，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)懸浮細菌，清洗2次。用Sauton培養(yǎng)基懸浮細菌，調(diào)整菌液密度至OD600=0.6，稀釋50倍，在24孔板中加入 1.3 mL菌液，四周孔加入1 mL無菌水，用封口膜封口。37 ℃靜置培養(yǎng)4、6周后，在連續(xù)變倍體顯微鏡下觀察細菌生物膜形成。

1.2.8 脅迫實驗調(diào)整野生株和敲除株密度至OD600=0.6，分別以pH 5.0 的7H9+OADC培養(yǎng)基、含 0.05% SDS的7H9+OADC培養(yǎng)基、含5 mmol H2O2的7H9+OADC培養(yǎng)基于37 ℃處理菌液 1.5 h及50 ℃水浴處理菌液 1.5 h。對處理前后菌液進行10倍梯度稀釋，吸取100 μL稀釋液涂布于7H10+OADC平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4周后，進行細菌菌落形成單位計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 p0004S-ΔlepA質(zhì)粒的構(gòu)建

以結(jié)核分枝桿菌H37Ra全基因組DNA為模板，通過PCR擴增lepA基因左、右臂，大小均約950 bp。用Van91Ⅰ 分別酶切p0004S質(zhì)粒及l(fā)epA基因左、右臂PCR產(chǎn)物，膠回收p0004S質(zhì)粒上 3.6、1.6 kb片段，以及l(fā)epA基因左、右臂片段。連接4個片段并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含150 μg/mL潮霉素的LB平板上篩選陽性克隆。抽提質(zhì)粒，經(jīng)Van91Ⅰ酶切驗證，分別獲得 3.6、1.6 kb和950 bp的片段，與預(yù)期目的條帶一致(圖1)。進行測序驗證，約950 bp的片段對應(yīng)lepA基因左、右臂，表明成功構(gòu)建p0004S-ΔlepA質(zhì)粒。

Lane M: DL10000 marker; lane 1: p0004S-ΔlepAplasmid.

圖1 p0004S-ΔlepA質(zhì)粒限制性酶切鑒定

Fig.1 Restriction enzyme digestion identification of p0004S-ΔlepAplasmid

2.2 phAE159-ΔlepA穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

用PacⅠ酶切phAE159質(zhì)粒(46.9 kb)和p0004S-ΔlepA質(zhì)粒(約7 kb)，連接兩酶切后的片段。通過噬菌體體外包裝試劑盒，將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化HB101感受態(tài)，涂布于含150 μg/mL潮霉素的LB平板上篩選陽性克隆。挑取4個單克隆菌落(圖2中3～6泳道)，抽提質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ 酶切驗證，有2個重組質(zhì)粒分別獲得約7 kb的小片段和>10 kb的大片段，與預(yù)期目的條帶一致(圖2中5～6泳道)。

Lane M: DL10000 marker; 1ane 1: phAE159 plasmid; lane 2: p0004S-ΔlepAplasmid; lane 3-6: four phAE159-ΔlepAplasmids respectively.

圖2 phAE159-ΔlepA穿梭質(zhì)粒限制性酶切鑒定

Fig.2 Restriction enzyme digestion identification of phAE159-ΔlepAplasmid

同時，將PacⅠ 酶切phAE159質(zhì)粒作為陰性對照(圖2中1泳道)，酶切p0004S-ΔlepA質(zhì)粒作為陽性對照(圖2中2泳道)。經(jīng)測序驗證，兩片段分別對應(yīng)p0004S-ΔlepA質(zhì)粒和phAE159質(zhì)粒，表明克隆3與克隆4(圖2中5～6泳道)為成功構(gòu)建的phAE159-ΔlepA穿梭質(zhì)粒。

2.3 噬菌體擴增

取2 μg phAE159-ΔlepA穿梭質(zhì)粒電轉(zhuǎn)恥垢分枝桿菌 mc2155感受態(tài)細胞，37 ℃復(fù)蘇4 h或過夜，加入top agar混勻，鋪于LB平板上，30 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2～3 d，可觀察到生長出的噬菌斑(圖3)。

圖3 噬菌體phAE159-ΔlepA

Fig.3 Phage of phAE159-ΔlepA

挑取4～5個噬菌斑到EP管中，加入200 μL MP緩沖液，4 ℃過夜。取上清液50 μL加至300 μL新鮮培養(yǎng)的mc2155菌液中，再與top agar混勻，鋪于LB平板上。待噬菌斑緊密相連，將噬菌斑刮到離心管中，加入適量MP緩沖液，4 ℃過夜，用 0.22 μm濾器過濾上清液，4 ℃保存。

將噬菌體以10倍梯度進行稀釋，取各梯度噬菌體與新鮮培養(yǎng)的mc2155菌液混合。以上述同樣方式鋪于LB平板上，2～3 d 后統(tǒng)計平板上噬菌斑個數(shù)，計算噬菌體滴度，達1010cfμ/mL 以上即可。

2.4 lepA基因敲除菌株的構(gòu)建

將噬菌體侵染結(jié)核分枝桿菌H37Ra感受態(tài)細胞，侵染的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為細菌∶噬菌體=1∶10。在含有75 μg/mL潮霉素的7H10+OADC平板上37 ℃培養(yǎng)4周時，出現(xiàn)一個結(jié)核分枝桿菌微小單克隆菌落。繼續(xù)培養(yǎng)至6周時，挑取該單克隆菌落于液態(tài)7H9+OADC培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。抽提菌株基因組DNA為模板，以lepA基因左臂遠端序列和右臂遠端序列設(shè)計正、反向引物(lepA-S/lepA-A)，進行PCR鑒定。鑒定原理如圖4A所示。瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，野生株(wild-type，WT)擴增得到包含左臂(950 bp)、lepA全基因(1 962 bp)及右臂(950 bp)共約 4 kb 的條帶，但由于結(jié)核分枝桿菌全基因組中的lepA基因被sacB+hyg 區(qū)域(3 600 bp)置換，lepA基因敲除株擴增得到的條帶約 5.5 kb，與預(yù)期目的條帶相符(圖4B)。將目的片段切膠回收后進行序列測定，結(jié)果顯示結(jié)核分枝桿菌全基因組中的lepA基因已被sacB+hyg 區(qū)域置換，提示該陽性克隆為構(gòu)建成功的結(jié)核分枝桿菌lepA基因敲除株(RaΔlepA，KO)。

A:Schematic diagram of PCR identification. B: Identification oflepAgene deletion mutant by PCR.

圖4lepA基因敲除株的構(gòu)建

Fig.4 Construction oflepAgene deletion mutant

利用兔抗EF4多克隆抗體進一步檢測野生株和敲除株中EF4的表達。將生長至對數(shù)期的野生株和敲除株超聲破碎后，取50 μg菌體蛋白上清液分別進行SDS-PAGE和蛋白免疫印跡檢測。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明野生株和敲除株全菌蛋白上樣量一致(圖5A)。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示，野生株中有EF4表達，敲除株中無EF4表達(圖5B)，進一步表明lepA基因已成功從結(jié)核分枝桿菌菌株中被敲除。此外，檢測EF4敲除株中其他蛋白的表達變化，包括與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染密切相關(guān)的異檸檬酸裂解酶ICL1和翻譯過程中的重要延伸因子且是結(jié)核分枝桿菌生長必需的EF-P。結(jié)果顯示，lepA基因敲除后ICL1表達量下調(diào)(相對分子質(zhì)量47×103)，EF-P表達量無明顯差異(相對分子質(zhì)量20×103)。

A:SDS-PAGE of wild-type andlepAgene deletion mutant. B: EF4 detected by Western blotting. C: ICL1 and EF-P detected by Western blotting.

圖5lepA基因敲除株的EF4、ICL1、EF-P蛋白表達水平

Fig.5 Protein expression of EF4，ICL1，EF-P inlepAgene deletion mutant

2.5 野生株和敲除株的菌落形態(tài)及生長曲線分析

為分析敲除株的菌落形態(tài)和生長曲線是否存在變化，取7H10+OADC平板上生長6周的敲除株和野生株的菌落在連續(xù)變倍體顯微鏡下進行菌落形態(tài)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者形態(tài)存在差異，相比于野生株，敲除株皺褶更聚集，形態(tài)偏厚，顏色發(fā)黃(圖6A)。但在正常培養(yǎng)條件下，野生株與敲除株生長趨勢一致，無明顯差異(圖6B)，表明EF4編碼基因的敲除對正常條件下結(jié)核分枝桿菌的生長無影響。

2.6 野生株和敲除株生物膜形成能力的分析

為分析敲除株的生物膜形成能力，采用 Sauton 培養(yǎng)基在24孔板中分別培養(yǎng)野生株和敲除株4、6周后，利用連續(xù)變倍體顯微鏡觀察兩者生物膜形成。結(jié)果顯示，細菌生長4周時，野生株和敲除株均在液面表層形成一層薄的生物膜，且野生株形成少量皺褶，而敲除株幾乎沒有皺褶形成；6周時，野生株和敲除株均觀察到形成大量褶皺，相較于野生株，敲除株生物膜皺褶偏少，且趨于分散(圖7)。

2.7 野生株和敲除株耐脅迫能力的分析

為檢測EF4是否與細菌抗逆相關(guān)，分別用pH 5.0 的7H9+OADC培養(yǎng)基、含 0.05% SDS的7H9+OADC培養(yǎng)基、含5 mmol H2O2的7H9+OADC培養(yǎng)基以及50 ℃水浴處理結(jié)核分枝桿菌野生株和EF4敲除株，比較野生株與敲除株在耐酸、耐熱、抗去垢劑、抗氧化逆境中的存活率。結(jié)果顯示，相較于野生株，敲除株耐酸能力顯著提高(圖8A)，耐熱、抗去垢劑、抗氧化能力無顯著差異(圖8B～D)。

A:Colony morphology. B: Growth curve.

圖6 野生株和敲除株菌落形態(tài)及生長曲線分析

Fig.6 Analysis of colony morphology and growth curve in wild-type andlepAgene deletion mutant

Biofilm formation were analysed after four weeks and seven weeks respectively.

圖7 野生株和敲除株生物膜形成能力分析

Fig.7 Analysis of biofilm formation in wild-type andlepAgene deletion mutant

3 討論

結(jié)核病是一種慢性致死性疾病，其致死率僅次于艾滋病，嚴重威脅著人類健康。據(jù)統(tǒng)計，全世界約1/3的人口是結(jié)核分枝桿菌攜帶者。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2018年《全球結(jié)核病報告》顯示，2017年有 1 000 萬人感染結(jié)核分枝桿菌，157萬人死亡。結(jié)核分枝桿菌的致病機制十分復(fù)雜，全基因組 4 000 個左右的編碼序列中有很多基因的功能還未知，對這些未知功能基因進行研究十分必要。

基因敲除是研究基因功能的重要技術(shù)，但結(jié)核分枝桿菌基因敲除株的構(gòu)建十分困難，主要原因如下：①結(jié)核分枝桿菌細胞壁厚，含有大量分枝菌酸，外源質(zhì)粒難以進入；②結(jié)核分枝桿菌基因組同源重組效率低，傳統(tǒng)的利用同源重組原理將含有等位交換底物的自殺性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到細菌中的敲除方法獲得的單交換及假陽性率高；③結(jié)核分枝桿菌生長周期長，單克隆生長需要3～4周，故敲除株構(gòu)建周期長。

A:pH resistance; B: Heat resistance; C: Detergent resistance; D: Oxidant resistance.

圖8 野生株和敲除株耐脅迫能力分析

Fig.8 Analysis of stress resistance in wild-type andlepAgene deletion mutant

本研究利用高滴度溫敏型噬菌體特異性侵染分枝桿菌，使靶向目的基因發(fā)生同源重組，高效實現(xiàn)了lepA基因敲除株的構(gòu)建。該方法將同源重組區(qū)域插入phAE159質(zhì)?；蚪M中，而phAE159質(zhì)粒含有分枝桿菌噬菌體的編碼信息，利用這一特性，用重組的分枝桿菌噬菌體侵染結(jié)核分枝桿菌感受態(tài)細胞進行高效率同源重組；同時獲得的phAE159-ΔlepA為穿梭質(zhì)粒，既可在大腸埃希菌又可在分枝桿菌中復(fù)制。這一特性使得前期實驗可在大腸埃希菌和恥垢分枝桿菌中進行操作，大大縮短了敲除所需的實驗周期[22]。

本研究所用噬菌體是溫敏型噬菌體，在30 ℃裂解生長，在37 ℃溶原生長[23]。故可在30 ℃感染恥垢分枝桿菌進行噬菌體擴增，在37 ℃侵染結(jié)核分枝桿菌，使之溶原生長整合到結(jié)核分枝桿菌基因組中，從而提高同源重組和基因敲除的效率。盡管該方法的基因敲除過程比較復(fù)雜，但最終篩選成功敲除菌株的概率通常較高[21]，本研究中平板上僅出現(xiàn)1個陽性結(jié)核分枝桿菌克隆即為成功的敲除株也證實其定位敲除的高效性。

生長曲線分析表明，正常培養(yǎng)條件下結(jié)核分枝桿菌野生株與lepA基因敲除株生長趨勢一致。在大腸埃希菌lepA敲除株中也發(fā)現(xiàn)，lepA基因敲除對細菌正常生長狀態(tài)沒有顯著影響[24]。研究顯示，大腸埃希菌中EF4可在高Mg2+濃度[15]、低pH[16]和低溫[15]壓力條件下加速蛋白質(zhì)合成，并為這些不利生長條件下的細胞提供生存能力方面的優(yōu)勢。另一項研究也表明，EF4有助于大腸埃希菌對亞碲酸鹽的抗性[17]。另一方面，EF4編碼基因lepA的缺失可在幾種致死應(yīng)激條件下幫助其存活[18]?？傊?，這些研究結(jié)果表明，EF4在體內(nèi)可能具有多種生理功能。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌EF4編碼基因lepA敲除后，細菌的耐酸特性明顯增強，在鳥分枝桿菌EF4突變株中也有類似發(fā)現(xiàn)[20]。盡管鳥分枝桿菌EF4突變株研究發(fā)現(xiàn)突變株在巨噬細胞內(nèi)生長能力下降，但此研究中感染巨噬細胞的野生菌株與突變菌株的起始感染量有很大差異，所以認為EF4影響鳥分枝桿菌的毒力還需要進一步斟酌。本研究發(fā)現(xiàn)，EF4敲除株菌落顏色發(fā)黃，凸起偏厚，通常在結(jié)核分枝桿菌脂質(zhì)合成或細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變異時會導(dǎo)致菌落表型發(fā)生類似變化[25]，提示EF4可能與結(jié)核分枝桿菌的細胞壁脂質(zhì)合成有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌的脂質(zhì)與其毒力和宿主內(nèi)生存密切相關(guān)，且異檸檬酸裂解酶ICL1是結(jié)核分枝桿菌細胞內(nèi)生存的關(guān)鍵基因，EF4敲除后明顯影響了其表達；同時考慮到結(jié)核分枝桿菌EF4突變株耐酸性增強，提示lepA可能與分枝桿菌的毒力相關(guān)，但需要利用動物感染模型來深入探索。