吳化葉，牟唐維，徐興麗，馮驍，王麗春，范勝濤，李琦涵

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明 650118

單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)是雙鏈DNA病毒。作為具有復(fù)雜基因結(jié)構(gòu)及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的雙鏈DNA病毒，其能編碼多種具有不同生物學(xué)功能的分子[1]。這些分子大多數(shù)可能不被病毒復(fù)制所需，但在病毒感染過程及與宿主細(xì)胞相互作用中為病毒增殖建立系統(tǒng)、有效的微環(huán)境具有十分重要的意義[2-4]。從HSV-1引起的急性感染、潛伏感染及其相關(guān)臨床表征來看，認(rèn)識病毒編碼分子與宿主細(xì)胞及機(jī)體的相互作用，對HSV-1相關(guān)疾病的監(jiān)控及預(yù)防具有重要意義[5]。

目前，基于HSV-1編碼的多種分子的作用對感染組織的病理機(jī)制進(jìn)行探討，常用的方法是利用基因修飾突變制備相關(guān)毒株，并針對這類毒株的生物學(xué)特性分析相關(guān)病毒編碼分子與特定病理機(jī)制的關(guān)系[6]。本課題組前期工作已對HSV-1編碼衣殼蛋白進(jìn)行綜合探索，制備了具有明確減毒表型的M3減毒株(M3株)，包括病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子UL7、病毒毒力因子Vhs及潛伏相關(guān)LAT基因的修飾突變[7]。分析M3株的生物學(xué)特性及感染能力，發(fā)現(xiàn)與野生型毒株(McKrae株)相比，其具有極低增殖能力和低致病能力[8]。同時(shí)，通過建立小鼠及恒河猴感染模型，發(fā)現(xiàn)M3株可引起相應(yīng)的保護(hù)性免疫反應(yīng)[4,8]，但這一免疫保護(hù)效應(yīng)尚不能完全控制小鼠或恒河猴在McKrae株攻擊時(shí)病毒在神經(jīng)系統(tǒng)(尤其是在三叉神經(jīng)節(jié))中的增殖?；谶@些結(jié)果，本研究針對以往確定的具有抑制細(xì)胞凋亡的病毒編碼基因us3[9]，對M3減毒株進(jìn)行進(jìn)一步的修飾突變，使us3基因發(fā)生146 bp缺失，獲得M4突變株(M4株)。假設(shè)病毒感染所表現(xiàn)的宿主細(xì)胞凋亡是機(jī)體天然免疫反應(yīng)中的一部分，對抑制病毒在機(jī)體中的擴(kuò)散和增殖具有重要作用，那么HSV-1編碼抑制細(xì)胞凋亡分子是病毒免疫逃逸機(jī)制之一[10]，而抑制HSV-1抗細(xì)胞凋亡能力有可能促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)增強(qiáng)，從而降低病毒感染率。為此，本研究系統(tǒng)觀察了M4株在BALB/c小鼠中的感染特征、致病能力及細(xì)胞凋亡情況，證明抑制us3基因可使HSV-1的減毒特征明顯增強(qiáng)并促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

100只無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級BALB/c雌性小鼠(4周齡)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[動物合格證號：SCXK(京)2016-0006]，小鼠的飼養(yǎng)和管理均遵循《實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理和使用指南》。本動物實(shí)驗(yàn)操作在生物安全2級(biosafety level 2，BSL-2)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 毒株及細(xì)胞

病毒滴度以細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(50% cell culture infective dose，CCID50)表示。HSV-1毒株如下：McKrae株，106.25CCID50/mL；M3株，105CCID50/mL；M4株，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在M3減毒株[11]的基礎(chǔ)上使us3基因146 bp的序列(CCTGGGGGACTTTGGCGCCGCGTGCTTCG-T G C A G G G T T C C C G A T C A A G C C C C T T C C C C T-ACGGA A T C G C C G G A A C C A T C G A C A C C A A C-GCCCCCGAGGTCCTGGCCGGGGATCCGTAT-ACCACGACCGTCGACATTTGGAGCGCCG)缺失制備而成，106.3CCID50/mL。以上HSV-1毒株和Vero、KMB-17細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所病毒免疫室提供，人急性T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(Jurkat細(xì)胞)購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.3 主要試劑

1%胰酶、4%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、400 U/mL青霉素/鏈霉素、MEM培養(yǎng)基、3%谷氨酰胺、6.6% 碳酸氫鈉、小牛血清均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunospot assay，ELISpot)相關(guān)試劑盒購自瑞典MabTech公司，小鼠淋巴細(xì)胞分離液、ELISpot專用培養(yǎng)基、PHA購自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，TRIzol RNA提取試劑購自天根生化科技(北京)有限公司，組織核酸提取試劑盒購自美國Axygen公司，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)相關(guān)試劑盒購自日本TaKaRa 公司，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)和凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，所用探針、引物和抗原肽由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 q-PCR引物

Tab.1 Oligonucleotides used for q-PCR

NameSequence (5'-3')GAPDHF:AGGTCGGTGTGAACGGATTTGR:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCATNF-αF:GACGTGGAACTGGCAGAAGAGR:TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAGIL-1βF:GCAACTGTTCCTGAACTCAACTR:ATCTTTTGGGGTCCGTCAACTIL-12βF:TGGTTTGCCATCGTTTTGCTGR:ACAGGTGAGGTTCACTGTTTCTIL-23F:AATAATGTGCCCCGTATCCAGTR:GCTCCCCTTTGAAGATGTCAG

1.4 增殖動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

將已知滴度的病毒液以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=0.1 接種至KMB-17單層T12.5密封培養(yǎng)瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。每隔8 h收一次樣，共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。-80 ℃凍融后，3次生物學(xué)重復(fù)。按Reed-Muench法統(tǒng)計(jì)病毒滴定結(jié)果并繪制增殖動力曲線[12]。

1.5 HSV-1感染小鼠及各項(xiàng)指標(biāo)檢測

1.5.1 分組將小鼠隨機(jī)分為3個(gè)感染組(McKrae、M3、M4組)，每只攻毒劑量為1×104CCID50，每組共設(shè)8個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12 h、24 h、48 h、72 h、7 d、28 d、56 d、84 d)；另設(shè)M3、M4組(每組10只)，分別在初次免疫后第45 天再次進(jìn)行1×104CCID50McKrae株感染，攻毒后第3、7天處死；以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)為對照組。以上感染方式均為噴鼻，每組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3只。

1.5.2 臨床癥狀觀察感染后觀察小鼠是否出現(xiàn)弓背、倒毛、單側(cè)眼視力喪失、四肢癱瘓、瀕死或死亡等臨床癥狀。連續(xù)10 d記錄各組小鼠存活狀況和體重變化。

1.5.3 組織病理檢測各組在12 h、24 h、48 h、72 h、7 d取小鼠腦和脊髓組織， 10%中性甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行H-E染色和封固，顯微鏡下觀察病變。

1.5.4 組織病毒載量檢測采集病毒感染后(12 h、24 h、48 h、72 h、7 d、28 d)的小鼠腦、三叉神經(jīng)、脊髓、氣管組織，稱重后勻漿研磨，按AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit操作說明書提取病毒核酸，按Premix Ex TaqTM試劑盒說明書配制反應(yīng)體系進(jìn)行絕對定量PCR。以HSV-1基因組高度保守區(qū)gG基因設(shè)計(jì)引物和探針[13]。上游引物：5′-TCCTSGTTCCTMACKGCCTCCC-3′；下游引物：5′-GCAGICAYACGTAACGCACGCT-3′；探針：6FAM-CGTCTGGACCAACCGCCACA-CAGGTTAMRA。

1.5.5 細(xì)胞因子表達(dá)分析使用TRIzol試劑從肺、口、鼻、淋巴組織提取RNA，按One Step SYBR?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR(20 μL體系)。反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共39個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.5.6 T細(xì)胞功能分析頸椎脫臼處死小鼠，無菌操作取小鼠脾臟，分離單核細(xì)胞。用Mouse IFN-γ ELISpotPLUS(HRP)、Mouse IL-4 ELISpotPLUS(HRP)試劑盒，以HSV-1抗原肽gB499-506:SSIEFARL和RR822-829:QTFDFGRL為刺激物(10 μg/mL)，檢測分泌γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)和白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)的特異性T細(xì)胞增殖狀況。

1.5.7 中和抗體效價(jià)檢測采集小鼠血清(28 d、56 d、84 d)，從1∶4開始進(jìn)行倍比稀釋(1∶4、1∶8、1∶16……1∶512)。將稀釋血清以50 μL/孔加入96孔板，加入已知滴度為2×103CCID50/mL的病毒樣品50 μL，在37 ℃中和2 h，加入消化的Vero細(xì)胞懸液，7 d后觀察細(xì)胞病變。

1.5.8 細(xì)胞凋亡測定將McKrae、M3、M4株以MOI=1接種于Jurkat細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，按凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。同時(shí)將細(xì)胞固定，進(jìn)行DAPI染色，顯微鏡下觀察凋亡小體。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行圖表繪制，SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行小鼠存活率分析，其余數(shù)據(jù)采用雙獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M4株的鑒定及 M3、M4株細(xì)胞水平的增殖動力學(xué)分析

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)制備基于M3株us3基因缺失的M4株，且經(jīng)電泳和測序驗(yàn)證構(gòu)建成功。在人二倍體細(xì)胞KMB-17細(xì)胞中，將M3、M4株以 MOI=0.1進(jìn)行接種，每8 h間隔收樣，進(jìn)行病毒增殖動力學(xué)分析。結(jié)果顯示，M4株在細(xì)胞水平的增殖能力與M3株基本一致，表明us3基因缺失并不影響M4株的體外增殖(圖1)。

2.2 M3和M4株感染BALB/c小鼠均無臨床癥狀

BALB/c小鼠常作為研究HSV-1致病性的動物模型，小鼠臨床表現(xiàn)與毒株致病性有關(guān)，強(qiáng)致病性毒株可導(dǎo)致小鼠死亡。本研究以每只1×104CCID50的劑量對BALB/c小鼠分別進(jìn)行McKrae、M3和M4株感染，逐日觀察小鼠臨床癥狀，對體重、生存率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。McKrae組小鼠從第3天開始出現(xiàn)精神不振、食欲下降、弓背、倒毛、單側(cè)眼失明、體重下降并逐漸死亡，至第6天全部死亡。但M3和M4組小鼠無明顯臨床表現(xiàn)，體重穩(wěn)定增加，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。結(jié)果提示，作為缺失特定基因的M3、M4株，其生物學(xué)性狀已發(fā)生改變，與McKrae株相比對小鼠的致病性明顯降低(圖2)。

圖1 M4株的缺失驗(yàn)證及與M3株增殖動力學(xué)的比較

Fig.1 Deletion verification of M4 mutant strains and proliferation kinetics compared with M3 strains

A: Survival rates. B: Weight change.

圖2 小鼠感染McKrae、M3和M4株后生存率和體重的變化

Fig.2 Survival rates and weight change in McKrae, M3 and M4 groups

2.3 us3基因突變可下調(diào)M4株在小鼠主要器官中的增殖

基于對臨床癥狀的觀察，且M4株在細(xì)胞水平的增殖未有改變，為了解其在小鼠體內(nèi)的增殖能力是否改變，本研究采用定量PCR檢測病毒感染后急性期和潛伏期神經(jīng)組織(包括腦、脊髓、三叉神經(jīng))及氣管組織中的病毒載量。結(jié)果表明，M3和M4組小鼠神經(jīng)和氣管組織中病毒載量明顯低于McKrae組，且M4組低于M3組；特別是在潛伏期(28 d)，病毒在組織中的增殖能力顯著低于McKrae組(圖3)。

A: Brain. B: TG. C: Spinal cord. D: Trachea.

圖3 McKrae、M3、M4株感染小鼠后神經(jīng)組織及氣管中的病毒載量

Fig.3 Viral loads in neural and trachea tissues in McKrae, M3 and M4 groups

2.4 us3基因突變保持了M3株的減毒特征

病毒在感染過程中首先經(jīng)破損的皮膚或黏膜途徑進(jìn)入機(jī)體，然后在上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，沿神經(jīng)軸索逆向移動，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病理損傷。為進(jìn)一步了解病毒增殖與病理損傷程度之間的關(guān)系，本研究對小鼠神經(jīng)組織(包括腦、脊髓)進(jìn)行組織石蠟切片及H-E染色。McKrae組小鼠在感染后均出現(xiàn)明顯的組織損傷，可觀察到腦組織蛛網(wǎng)膜充血，脊髓中見大量膠質(zhì)小結(jié)。M3、M4組小鼠未見明顯病理損傷(圖4)，與病毒在組織中的低增殖一致，提示us3基因的缺失并不影響M3株的減毒特征。

2.5 us3基因突變下調(diào)機(jī)體炎癥反應(yīng)

病毒侵入機(jī)體后，在不同組織中表現(xiàn)出不同的增殖能力并引發(fā)炎癥反應(yīng)，其中重要的炎性因子和促炎因子包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、IL-23和IL-12β。本研究檢測小鼠感染48 h后肺、口、鼻、淋巴組織中以上因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)M4組肺中的TNF-α、口中的IL-1β、鼻中的IL-12β、淋巴結(jié)中的IL-23細(xì)胞因子表達(dá)較McKrae組、M3組顯著下降，這與M4株的復(fù)制增殖能力降低和病理損傷表現(xiàn)一致，推測us3基因的功能性抑制可下調(diào)機(jī)體炎癥反應(yīng)(圖5)。

2.6 M3、M4株誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)

在M4株誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)水平較低的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步了解病毒誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫，本研究于免疫后28 d、56 d、84 d采集并分離小鼠血清和脾淋巴細(xì)胞，檢測中和抗體效價(jià)及分泌IFN-γ和IL-4的特異性T細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，M3、M4株均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生陽性血清中和抗體，56 d時(shí)效價(jià)最高， 且M4株誘導(dǎo)的中和抗體水平較M3株顯著升高。28 d、56 d時(shí)M4株引起的特異性T細(xì)胞反應(yīng)顯著高于M3株，與中和抗體效價(jià)趨勢表現(xiàn)一致(圖6)。以上結(jié)果提示，us3基因突變提高了機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。

2.7 M4株有更強(qiáng)的抑制體內(nèi)病毒增殖的能力

HSV-1感染具有潛伏性，在適宜條件下可被重新激活，造成機(jī)體反復(fù)感染。為模擬這一過程，本研究在小鼠初次免疫M(jìn)3、M4株后第45天再次行McKrae株鼻腔感染，以驗(yàn)證M3、M4株是否具有抑制體內(nèi)病毒增殖的能力。在感染后的第3天和第7天，取小鼠臟器(如肺、鼻、肝、腎)進(jìn)行病毒載量檢測。結(jié)果顯示，M3、M4組較對照組病毒載量明顯降低，且M4組明顯低于M3組。這些結(jié)果表明，us3基因突變可能促進(jìn)對病毒的有效清除及控制能力(圖7)。

A:Brain. B: Spinal cord.

圖4 McKrae、M3、M4株感染小鼠后腦和脊髓的病理檢測

Fig.4 Histopathological examinations of the brain and spinal cord in McKrae, M3 and M4 groups

A:TNF-α in Lung. B: IL-1β in Mouth. C: IL-12β in Nose. D: IL-23 in Lymph nodes.

圖5 各毒株感染小鼠48 h后肺、口、鼻、淋巴結(jié)組織中炎性細(xì)胞因子的比較

Fig.5 Comparison of inflammatory cytokines in lung, mouth, nose and lymph node tissues in mice after 48 h of infection

A:Serum neutralizing antibody. B: IFN-γ secretion from spleen T cells. C: IL-4 secretion from spleen T cells.

圖6 免疫后小鼠血清中和抗體和脾細(xì)胞免疫反應(yīng)

Fig.6 Serum neutralizing antibodies and spleen cell immune response in mice

A:Lung. B: Nose. C: Liver. D: Kidney.

圖7 免疫小鼠再次感染McKrae株后各組織中病毒載量

Fig.7 Viral loads in tissues of immunized mice reinfected with McKrae strains

2.8 us3基因功能性抑制可增強(qiáng)M4株誘導(dǎo)的體外細(xì)胞凋亡

us3基因可通過影響細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)因子活性而介導(dǎo)HSV抗宿主細(xì)胞凋亡，參與病毒免疫逃逸，且M4株在動物體內(nèi)表現(xiàn)為低增殖能力。那么缺失us3基因的M4株在體外是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡？本研究以MOI=1的HSV-1感染Jurkat細(xì)胞，24 h后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和形態(tài)學(xué)檢測分析。結(jié)果顯示，與McKrae和M3株相比，M4株引起的凋亡比例顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8)。由此推測，us3基因缺失可促進(jìn)HSV-1對宿主細(xì)胞凋亡的抑制作用下降，從而有效控制HSV-1的增殖和擴(kuò)散。

3 討論

由于皰疹病毒的復(fù)雜性和潛伏性，到目前為止，尚無有效疫苗來預(yù)防和治療單純皰疹[14]。HSV感染宿主具有兩個(gè)明顯特征：嗜神經(jīng)性及潛伏感染。神經(jīng)毒性是指HSV可感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)細(xì)胞中復(fù)制而影響神經(jīng)細(xì)胞功能；潛伏感染是指HSV侵犯機(jī)體后，可在神經(jīng)細(xì)胞以潛伏狀態(tài)存在，不能被完全清除，在適當(dāng)因素刺激后HSV被重新激活而引發(fā)皰疹等癥狀[15]。在深入探討這些復(fù)雜機(jī)制及其相互作用關(guān)系的過程中，本研究構(gòu)建了一系列減毒株，包含M3和M4株，M3株的致病性和潛伏能力與McKrae株相比大幅下降[4,8]，但改變us3基因?qū)ζ錅p毒表型的影響尚需進(jìn)一步結(jié)合其功能加以分析。

A:Stained Jurkat cells. B: Flow cytometry detection of Jurkat cells. C: Comparison of apoptosis in M3, M4 and M groups.

圖8 McKrae、M3、M4株感染Jurkat細(xì)胞24 h后的凋亡檢測

Fig.8 Apoptosis detection after infection of Jurkat cells by McKrae, M3 and M4 strains for 24 h

眾所周知，HSV在與宿主的長期進(jìn)化過程中，能隨環(huán)境的變化而表現(xiàn)出不同的感染特點(diǎn)。一方面，病毒充分利用宿主的合成系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)自我迅速增殖，另一方面能影響和控制宿主細(xì)胞凋亡能力，延遲或抑制細(xì)胞凋亡，從而維護(hù)病毒賴以生存的環(huán)境。us3為HSV-1體外增殖的非必需基因，其產(chǎn)物US3蛋白激酶具有多種功能，如抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)等[16]。還有研究表明，us3可通過影響細(xì)胞凋亡內(nèi)部途徑相關(guān)因子的活性而調(diào)控細(xì)胞凋亡[17]?；谏鲜龇治?，本研究在M3株改造的基礎(chǔ)上使部分us3基因缺失突變，進(jìn)一步了解抑制細(xì)胞凋亡機(jī)制與病毒免疫逃逸特征的相互關(guān)系。

用BALB/c小鼠模型系統(tǒng)分析比較McKrae、M3和M4株的致病性、病理及炎性因子，結(jié)果顯示，M3、M4株的毒力明顯低于McKrae株，且M4株比M3株更具有減毒優(yōu)越性。本課題組前期研究表明，用M3株接種小鼠和恒河猴后，主要組織中病毒均出現(xiàn)一定程度的增殖，尤其是在三叉神經(jīng)節(jié)中保持潛伏狀態(tài)。本研究中，無論是直接接種還是接種后再次感染McKrae株，M4組在各組織中病毒載量均明顯低于M3組。推測us3基因突變后，受感染的細(xì)胞可正常進(jìn)入細(xì)胞凋亡程序，增加了病毒被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除的可能，所以M4組病毒增殖下降，但仍需更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來驗(yàn)證。

有研究表明，HSV-1us3基因可通過影響細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)因子的活性而介導(dǎo)抗宿主細(xì)胞凋亡。此過程中Bax、Bid、Bad是關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它們均屬Bcl家族成員。已有研究報(bào)道，US3蛋白激酶可阻斷Bad、Bid過表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡，可能與Bad 蛋白的112-Ser、136-Ser磷酸化及Bid過表達(dá)有關(guān)[18-19]。本研究中，與M3和McKrae株相比，M4株在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)為低水平增殖，推測可能是由于M4株缺失us3基因，其對宿主細(xì)胞凋亡的抑制作用下降，使受感染的細(xì)胞出現(xiàn)正常凋亡的比例增加，從而導(dǎo)致病毒增殖能力受限。

IFN-α/β作為天然免疫反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)者，在病毒感染過程中起非常重要的作用。HSV能在多個(gè)環(huán)節(jié)破壞這一信號通路。體外研究表明，HSV-1us3能限制IFN產(chǎn)生。在IFN處理過的人喉癌上皮細(xì)胞HEp-2中，與野生株相比，us3缺陷型HSV-1增殖被顯著抑制，且抑制程度與IFN劑量呈正相關(guān)。本研究ELISpot實(shí)驗(yàn)中，M4株與M3、McKrae株相比，IFN-γ抗原特異性T細(xì)胞明顯升高，原因可能是M4株缺失us3，導(dǎo)致小鼠體內(nèi) IFN-α/β 信號通路得以維持。

綜上所述，對編碼抑制細(xì)胞凋亡分子的HSV-1us3基因進(jìn)行修飾突變而獲得的M4株與M3株相比，表現(xiàn)出更好的減毒表型。雖然本研究僅采用了小鼠模型進(jìn)行分析，所得結(jié)果尚需探討，但為進(jìn)一步認(rèn)識HSV-1us3基因在病毒減毒特征中的作用提供了線索。