周昕，龍健兒

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系， 教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室， 上海 200032

腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)為小RNA病毒科腸道病毒屬(Enterovirus)成員，是單股正鏈RNA病毒[1]。EV71主要感染5歲以下的嬰幼兒，可導(dǎo)致嬰幼兒手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)。重癥患者可表現(xiàn)為無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹，甚至神經(jīng)源性肺水腫和肺出血[2-3]。目前EV71的致病機(jī)制尚不清楚，也沒有針對EV71感染有效的抗病毒藥物[4-5]。

腸道病毒主要通過糞-口途徑和密切接觸傳播，在其傳播和感染環(huán)境中存在著數(shù)量巨大的細(xì)菌群體[6]。有研究表明細(xì)菌可影響多種腸道病毒的感染和傳播，菌體脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)被認(rèn)為起著非常重要的作用[7]。

LPS又稱為內(nèi)毒素，是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組分，主要由疏水性的脂質(zhì)A和親水性的多糖(包括核心多糖和O特異性多糖)組成。已有研究報道，LPS可影響多種腸道病毒的穩(wěn)定性，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼠乳腺腫瘤病毒、呼腸孤病毒等[7-8]。在EV71的感染和傳播的環(huán)境中也存在大量細(xì)菌，因此，本研究對細(xì)菌LPS是否影響EV71的穩(wěn)定性和感染能力進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma, RD)細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29細(xì)胞)細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。EV71病毒株(GenBank 登錄號：HQ891927, 064-Shanghai)由本實驗室分離并保存。反轉(zhuǎn)錄試劑盒PtimeScript RT reagent Kit購自TaKaRa公司，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)購自上海翊圣生物科技有限公司，LPS(#L2880)購自Sigma公司，EV71-VP1(#MAB1255-M05)抗體購自Abnova公司，β-actin(#8H10D10)抗體購自Cell Signaling Technology公司，抗大腸埃希菌(Encherichiacoli,E.coli)抗體(anti-E.coli抗體)(#ab68450)購自Abcam公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記山羊抗鼠Ig(H+L)(#WB0177)購自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)RD細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/HG培養(yǎng)基培養(yǎng)，HT-29細(xì)胞用含10%胎牛血清的 McCOY 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞均置于5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長融合至95%～100%單層時進(jìn)行傳代。

1.2.2 病毒TCID50的測定病毒液處理：①等量EV71與相同濃度LPS(1 000 μg/ml)在42 ℃分別熱處理0、0.5、1、2、4、6 h；②等量EV71與不同濃度LPS(0、50、100、500、1 000 μg/ml)在42 ℃分別熱處理2 h；③等量EV71與相同濃度滅活E.coli(OD=0.5)在42 ℃分別熱處理0、0.5、1、2、4、6 h；④等量EV71與不同濃度滅活E.coli(OD=0、0.1、0.5、1)在42 ℃分別熱處理2 h。RD細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板中，將上述處理后的病毒液分別以10倍梯度進(jìn)行稀釋，不同稀釋度的病毒感染RD細(xì)胞，72 h后通過MTT法測定細(xì)胞活力。定義細(xì)胞活力<50%認(rèn)為有明顯的CPE且超過半數(shù)感染，通過細(xì)胞活力變化檢測病毒TCID50[9]。

1.2.3 實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測病毒基因的拷貝數(shù)為檢測LPS對EV71黏附、侵入及復(fù)制過程的影響，將EV71(MOI=0.5)與不同濃度LPS(0、50、100、500、1 000 μg/ml)在37 ℃溫育1 h，然后①黏附階段，EV71與LPS的混合液在4 ℃分別溫育RD細(xì)胞和HT-29細(xì)胞2 h，棄病毒液，TRIZOL收集細(xì)胞；②侵入階段，EV71與LPS的混合液在37 ℃分別感染RD細(xì)胞和HT-29細(xì)胞2 h，棄病毒液，TRIZOL收集細(xì)胞；③復(fù)制階段，EV71與LPS的混合液在37 ℃分別感染RD細(xì)胞和HT-29細(xì)胞12 h，棄病毒液，TRIZOL收集細(xì)胞。為檢測LPS對EV71釋放過程的影響，將EV71(MOI=0.5)與LPS(500 μg/ml)的混合液在37 ℃溫育1 h后，分別感染HT-29細(xì)胞0、24、48、72、96 h，TRIZOL分別收集感染不同時間點的細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。抽提RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒PtimeScript RT reagent Kit說明書進(jìn)行cDNA合成，按上海翊圣生物科技有限公司Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)說明書進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，并用2-ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達(dá)量。病毒蛋白VP1和內(nèi)參基因β-actin的mRNA引物設(shè)計如下：

VP1-F(5′-AGGAGATAGCGTGAGCAGAG-3′)；

VP1-R(5′-G C T G G A A C C T T G C C T G T A T-3′)；

β-actin-F(5′-GAAGTACCCCATCGAGCACG-3′)；

β-actin-R(5′-GGATAGCACAGCCTGGATAG-CA-3′)。

1.2.4 病毒純化① RD細(xì)胞接種于75 cm2細(xì)胞瓶中，用MOI=1的病毒液感染細(xì)胞2 h，棄病毒液，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含4% FBS的DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞完全病變后收集培養(yǎng)上清液；② 取適量HFMD患者糞便，研缽研磨糞便并用PBS稀釋，離心后收集上清液。在①、②收集的上清液中分別加入終濃度10% 的聚乙二醇，4 ℃放置過夜。離心，棄上清液，4 ℃溶解。離心，棄沉淀物，收集上清液。離心管底部加30%的蔗糖溶液作墊層，將收集的病毒液加于墊層上，超速離心。棄上清液，用適量PBS重懸沉淀物，4 ℃溶解后于 -80 ℃ 保存。

1.2.5 蛋白斑點雜交將EV71(總質(zhì)量為100 ng)和不同濃度LPS(0、50、100、500、1 000 μg/ml)的混合液(總體積為10 μl)在37 ℃溫育1 h，然后尼龍膜上點樣，并使液體自然風(fēng)干。尼龍膜在室溫封閉 2 h，與相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，再與相應(yīng)的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗在室溫孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence, ECL)檢測。

1.2.6 蛋白免疫印跡法收集的細(xì)胞樣品蛋白定量后，用含十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)的緩沖液處理，煮沸10 min。將上述制備好的蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，在室溫封閉2 h，與相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜。次日，與相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗在室溫孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光液檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析采用Graphpad Prism 6軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，用兩獨立樣本均數(shù)t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對EV71熱穩(wěn)定性的影響

為研究LPS對EV71熱穩(wěn)定性的影響，將相同濃度LPS與等量EV71溫育后，再經(jīng)42 ℃熱處理，分別測定不同時間的熱處理后殘留的病毒活力。結(jié)果顯示，隨著熱處理時間延長，病毒活力逐漸喪失，但經(jīng)LPS處理過的與未經(jīng)LPS處理的相比，病毒活力喪失速度減緩(圖1A)。將不同濃度LPS與等量EV71溫育后再經(jīng)42 ℃熱處理2 h，以不加LPS且未熱處理的病毒活力定義為100%。結(jié)果顯示，不加LPS的病毒被熱處理后活力喪失50%，而經(jīng)LPS處理的病毒殘留活力與LPS濃度呈正相關(guān)：用低濃度LPS處理，殘留病毒活力較低；而以高濃度LPS處理，殘留病毒活力較高(圖1B)。

由于LPS是細(xì)菌菌體的重要組分，為確認(rèn)細(xì)菌菌體對EV71熱穩(wěn)定性的影響能力，將熱滅活的E.coli與EV71溫育，再經(jīng)熱處理后測定殘留病毒活力。結(jié)果顯示，熱處理2 h后，病毒的活力顯著喪失，但經(jīng)E.coli處理后的病毒，活力喪失速度減緩(圖1C)；且殘留病毒活力與加入E.coli的劑量呈正相關(guān)(圖1D)。上述結(jié)果表明，LPS及滅活的E.coli菌體均可增強(qiáng)EV71的熱穩(wěn)定性。

2.2 LPS對EV71感染過程的影響

EV71對細(xì)胞的感染包括黏附、侵入、胞內(nèi)復(fù)制、釋放過程。為確認(rèn)LPS對EV71感染過程的影響，將不同濃度LPS與等量EV71溫育，并以不加LPS的病毒作為對照。在黏附階段，混合液與細(xì)胞在4 ℃作用2 h。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS處理后，黏附在細(xì)胞表面的病毒基因拷貝數(shù)較對照組均降低(圖2A、B)。在侵入階段，混合液在37 ℃感染細(xì)胞2 h。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞內(nèi)病毒基因拷貝數(shù)較對照組均顯著降低(圖2C、D)。在細(xì)胞復(fù)制階段，混合液在37 ℃感染細(xì)胞12 h。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞中病毒基因拷貝數(shù)較對照組均降低(圖2E、F)。在釋放過程階段，等量EV71與相同濃度LPS溫育，然后感染HT-29細(xì)胞0、24、48、72、96 h，并以未加LPS的病毒作為對照。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞內(nèi)病毒基因拷貝數(shù)均低于對照組，在感染72 h后釋放于培養(yǎng)上清液中的病毒滴度也顯著低于對照組(圖2G、H)。以上結(jié)果表明，LPS可抑制EV71的黏附、侵入、胞內(nèi)復(fù)制及釋放過程。

2.3 LPS與EV71的結(jié)合可能性分析

LPS可以增強(qiáng)EV71的熱穩(wěn)定性并抑制EV71的感染過程，推測其可能與EV71相結(jié)合。為檢測LPS能否與EV71相結(jié)合，將等量EV71與不同濃度LPS溫育，然后用不同的抗體進(jìn)行蛋白斑點雜交實驗。結(jié)果顯示，當(dāng)抗體為anti-E.coli時，斑點印跡的深淺與LPS濃度呈正相關(guān)；當(dāng)抗體為anti-VP1時，斑點印跡的深淺與LPS濃度呈負(fù)相關(guān)(圖3A)。

為進(jìn)一步檢測HFMD患者體內(nèi)的EV71能否與腸道中菌體LPS結(jié)合，將從病毒感染細(xì)胞后增殖產(chǎn)生的上清液及HFMD患者糞便中分離純化的EV71，用免疫印跡試驗檢測純化病毒液與anti-VP1和anti-E.coli抗體的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，上清液和糞便中純化出的病毒液均可被anti-VP1抗體識別(圖3B)，但只有糞便中純化出的病毒液可被anti-E.coli抗體識別(圖3C)。上述結(jié)果提示，LPS可能與EV71結(jié)合。

A:LPS increased the thermal stability of EV71. Mixture of EV71 and LPS (1 000 μg/ml) or PBS was heated at 42 ℃ for the indicated hours, then the virus TCID50was detected. B: LPS increased the viral thermal stability in a LPS concentration-dependent manner. EV71 was treated by LPS at indicated concentrations, then incubated at 42 ℃ for 2 h, then the virus TCID50were detected. C: The inactivatedE.coliincreased the thermal stability of EV71. The inactivatedE.coli(OD=0.5) were mixed with EV71 and heated at 42 ℃ for the indicated hours, then the virus TCID50was detected. D: The thermal stability of EV71 was dependent onE.coliODvalues. EV71 was treated by inactivatedE.coliat indicated concentrations, then incubated at 42 ℃ for 2 h, then the virus TCID50were detected. Data showed as the relative folds in comparision with that of input virus without treatment by heat and LPS orE.coli.*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.

圖1 LPS可增強(qiáng)EV71的熱穩(wěn)定性

Fig.1 LPS increased the thermal stability of EV71

A:Effect of LPS on the attachment of EV71 to RD cells. B: Effect of LPS on the attachment of EV71 to HT-29 cells. C: Effect of LPS on the entry of EV71 into RD cells. D: Effect of LPS on the entry of EV71 into HT-29 cells. E: Effect of LPS on EV71 replication in RD cells. F: Effect of LPS on EV71 replication in HT-29 cells. G: Relative viral genome copies in HT-29 cells. H: Relative viral genome copies in HT-29 cell culture supernatant.The data showed the relative folds of viral genome copies normalized by β-actin.*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.

圖2 LPS抑制EV71的感染過程

Fig.2 LPS inhibited the infection process of EV71

A:LPS binding to virus detected by dot-blot. Purified EV71 (100 ng in each dot) were incubated with LPS at indicated concentrations for 1 h to the protein dot blot hybridization. B: Western blot to detect the viruses from HFMD patients and the cell culture supernatant by anti-VP1 antibodies. C: Western blot to detect the viruses from HFMD patients and the cell culture supernatant by anti-E.coliantibodies.

圖3 LPS與EV71結(jié)合的分析

Fig.3 Analysis of the combination of LPS and EV71

3 討論

腸道病毒傳播和感染時，會接觸到大量的細(xì)菌[6, 10]。研究表明，細(xì)菌可影響多種腸道病毒的穩(wěn)定性和感染能力，其菌體組分LPS被認(rèn)為在此過程中起著非常重要的作用[7]。

細(xì)菌LPS可影響多種腸道病毒的穩(wěn)定性。在正常生理條件下，病毒可保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；當(dāng)溫度升高時，病毒的穩(wěn)定性遭到破壞，活力下降，感染能力降低。研究顯示，LPS可通過直接與脊髓灰質(zhì)炎病毒結(jié)合，增強(qiáng)病毒的熱穩(wěn)定性及對氯漂白劑的抵抗能力[11-13]。LPS還可增強(qiáng)其他小RNA病毒(如?？刹《?0、柯薩奇病毒A21和B5)的耐熱性，對氯漂白劑、紫外線(UV)等的耐受性，使病毒能夠穩(wěn)定存在[14]。LPS和革蘭陽性菌的成分肽聚糖也可增強(qiáng)呼腸孤病毒的熱穩(wěn)定性，但是具體的分子機(jī)制并不清楚[8]。由于在極端生理條件下，哺乳動物體溫有可能達(dá)到42 ℃；在實驗條件下，42 ℃處理病毒，病毒活性喪失速度減緩，容易檢測出病毒的活性變化，因此我們選擇了42 ℃進(jìn)行實驗來檢測LPS對EV71熱穩(wěn)定性的影響。在本研究中，通過將LPS處理過的病毒再進(jìn)行熱處理，測定殘留病毒活力，發(fā)現(xiàn)LPS處理組病毒活力喪失速度更慢，且殘留病毒活力與LPS濃度呈正相關(guān)，提示LPS可增強(qiáng)EV71的熱穩(wěn)定性。利用滅活的E.coli處理病毒也得到相似的結(jié)果，這與上述研究報道的結(jié)果一致[7-8, 11-14]。

LPS還可影響多種腸道病毒的感染過程。如脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)入細(xì)胞由細(xì)胞表面的脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(poliovirus receptor, PVR)介導(dǎo)，LPS能夠促進(jìn)病毒與靶細(xì)胞表面的PVR結(jié)合，使病毒黏附在靶細(xì)胞表面，從而促進(jìn)病毒感染細(xì)胞[12]；鼠乳腺腫瘤病毒通過結(jié)合LPS后激活TLR4信號通路，刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，然后誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，建立一個免疫抑制的微環(huán)境，從而使病毒能夠持續(xù)性感染[15-17]。在本研究中，我們用LPS處理的病毒感染不同類型的細(xì)胞，觀察在病毒黏附、侵入、胞內(nèi)復(fù)制、釋放過程中病毒基因拷貝數(shù)的變化，發(fā)現(xiàn)LPS處理組病毒基因拷貝數(shù)在病毒感染過程中較對照組均有不同程度的降低，提示LPS可以抑制EV71的感染過程，這與已經(jīng)報道的LPS對其他病毒感染影響的結(jié)果不同[12, 15-17]。LPS抑制EV71感染的機(jī)制尚不明確，我們分析有以下可能的原因：第一，LPS與EV71的結(jié)合阻止了EV71黏附在靶細(xì)胞上，從而抑制病毒的感染。由于EV71黏附細(xì)胞需要病毒VP1與細(xì)胞受體結(jié)合，而我們通過蛋白斑點雜交和免疫印跡試驗檢測發(fā)現(xiàn)LPS可以競爭性抑制anti-VP1抗體與病毒的結(jié)合似乎也表明了這一點。第二，LPS被Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)識別后，可能通過激活TLR4信號通路，進(jìn)一步激活下游的核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B, NF-κB)信號通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種抗病毒細(xì)胞因子，例如TNF-α和IFN，阻止病毒的感染。LPS影響EV71感染的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌LPS可增強(qiáng)EV71的熱穩(wěn)定性，抑制EV71的感染過程，推測LPS可能與EV71相結(jié)合。該結(jié)果可以加深我們對EV71感染及其致病過程的理解，對臨床防治EV71感染具有一定的指導(dǎo)意義。