鄭康，劉安元,2，吳移謀

1. 南華大學衡陽醫(yī)學院病原生物學研究所， 衡陽 421001； 2. 南華大學附屬第二醫(yī)院， 衡陽 421001

梅毒螺旋體蒼白亞種(Treponemapallidumsubsp.pallidum, TP)感染引起的性傳播疾病是全球公認的公共衛(wèi)生安全問題。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估計每年感染Tp的病例數(shù)為 3 600 萬例，新增感染人數(shù)超過 1 200 萬[1]，其中90%以上的梅毒感染病例集中在中低等收入國家，也常出現(xiàn)于歐洲、美國、加拿大和中國[2-4]。在美國，男男性行為者(men who have sex with men, MSM)引起的Tp發(fā)病率急劇上升，從2000年每10萬名MSM中15.8人感染Tp，上升到2013年的228.8人[5]。近年來，高收入和低收入國家的先天性Tp發(fā)病率在逐漸增加[6]。據(jù)統(tǒng)計全世界每年有136萬孕婦感染Tp，其中約52萬患者出現(xiàn)胎兒死亡[7]。中國的先天性梅毒病例也在逐漸升高,2013年中國疾病預(yù)防控制中心(Chinese Center for Disease and Prevention, CDC)報告每10萬名孕婦中有69.9名活產(chǎn)胎兒出現(xiàn)Tp感染[8-10]。Tp還能增加人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)陽性個體的傳染性和HIV陰性個體的易感性，使患者HIV的傳播和獲得風險增加2～5倍[11]。再者，攜帶HIV的MSM也被確定為有再次感染Tp風險的人群[12]。因此，通過有效的疫苗接種，早期預(yù)防并治療Tp的高危人群，對于防止Tp擴散，具有深遠的實際意義。

1 Tp的臨床特征

Tp感染后，大約在3周內(nèi)可出現(xiàn)以感染部位的皮膚損傷(硬下疳)為首發(fā)的臨床癥狀[13]。如果感染未能得到有效治療，3個月內(nèi)就可出現(xiàn)多種臨床癥狀：淋巴結(jié)腫大、全身皮疹等[13,14]。大約3個月后，Tp感染進入無癥狀潛伏期，包括早期潛伏期(初感染1年內(nèi)無臨床癥狀)和晚期潛伏期(1年以上無臨床癥狀或病程不明)。約有30%未經(jīng)治療的潛伏期患者出現(xiàn)Ⅲ期梅毒臨床癥狀(主要表現(xiàn)為樹膠腫、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)損傷、全身輕癱和脊髓癆)。先天性梅毒可導致新生兒流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)和死亡；幸存的嬰兒也可能出現(xiàn)先天性梅毒的癥狀，包括鼻炎、皮膚損傷、間質(zhì)角膜炎而失明及牙齒和骨骼畸形[14]。臨床癥狀每一階段表達的抗原不盡相同，多達數(shù)百種的獨特抗原使疫苗研發(fā)相對困難。

2 Tp疫苗研究的必要性

經(jīng)過70多年的抗生素使用，并沒有出現(xiàn)Tp感染的耐藥現(xiàn)象。目前Tp對青霉素治療非常敏感，但其患病率并沒有因此降低，反而在全世界范圍內(nèi)流行[15]。這一事實表明僅靠公共衛(wèi)生篩查和抗生素治療不太可能根除Tp感染。事實上，對Tp已經(jīng)實施多項強化的公共衛(wèi)生控制的舉措，這些舉措在減少主要人群發(fā)病率、提高醫(yī)務(wù)人員和公眾對Tp傳染性和先天性梅毒的認識、增加以公共衛(wèi)生和社區(qū)為基礎(chǔ)控制該病的服務(wù)及增加專門用于防治Tp和其他性傳播疾病感染的資金和資源方面具有不可估量的價值，但該病發(fā)病率仍然位居我國甲、乙類傳染病的第3位[16]。Tp在世界范圍內(nèi)持續(xù)流行，采取新的額外措施遏制Tp傳播的必要性尤為突出。其中一項措施就是Tp疫苗的研制與開發(fā)。然而有效的Tp疫苗將面臨諸多挑戰(zhàn)，主要包括：Tp感染的臨床診斷困難；臨床醫(yī)生對Tp感染期間可能出現(xiàn)的各種臨床癥狀缺乏了解[13]；目前實驗室診斷技術(shù)對早期Tp感染的檢測靈敏度較低[17,18]；盡管采取適當?shù)闹委?，由于抗Tp抗體保持可檢測性，準確診斷再感染仍具有一定的難度[18]；常規(guī)檢測方法對Tp感染的準確診斷依賴于患者的復(fù)診依從性，而有效的Tp治療依賴于足量青霉素，就目前而言青霉素處于長期短缺狀態(tài)[19,20]。這些挑戰(zhàn)將可通過開發(fā)有效的Tp疫苗而得到緩解。主要體現(xiàn)在以下幾個方面：①預(yù)防Tp感染，從而預(yù)防所有時期的Tp和母嬰傳播；②在不同Tp菌株間提供交叉保護，從而降低再感染的發(fā)生率；③消除對回訪和有效控制Tp感染而大量使用青霉素的依賴。綜上所述，接種疫苗將是一種對預(yù)防Tp感染和擴散極有價值的首選方法。

3 疫苗研究過程中候選抗原

與其他病原體疫苗研究相比，Tp存在一定技術(shù)上的限制(其外膜脆弱，人工培養(yǎng)和基因操控無法進行，Tp的基礎(chǔ)研究相對較少)，影響了Tp疫苗的進一步開發(fā)[13]。Tp疫苗的研究主要經(jīng)歷了滅活疫苗、減毒活疫苗、重組蛋白疫苗和DNA疫苗階段，這些研究尚未進入臨床應(yīng)用。Metzger等使用儲存在4 ℃的Tp分別靜脈注射和肌內(nèi)注射新西蘭兔，首次證實菌體抗原能產(chǎn)生部分性保護[21]。同時Miller課題組用γ射線處理的Tp菌體抗原免疫新西蘭兔獲得長達1年的抗Tp完全性保護[22]。由此說明劇烈的化學反應(yīng)或熱滅活可以破壞菌體表面抗原，為Tp保護性抗原的不穩(wěn)定性提供強有力的證據(jù)。再者抵抗有癥狀的同源菌株感染的完全性保護在感染后的第12周才出現(xiàn)。如果新西蘭兔前12周Tp感染得到治愈，12周后可出現(xiàn)再次感染。由此推測這種緩慢性免疫保護的變化與Tp特殊的表面蛋白稀少有關(guān)。假定γ射線處理過的Tp為非增生性的，而感染劑量的增加和時間的延長表明一個相似抗原的接觸過程就是感染Tp 12周內(nèi)未經(jīng)抗生素治療的過程。同時γ射線處理過Tp免疫的新西蘭兔獲得完全免疫保護(感染部位未見皮膚損傷，也未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)需要37周。因此我們可以從這些研究中得出一些重要結(jié)論：①Tp保護性免疫的研制依賴于未被破壞的完整菌體，保護性抗原具有敏感性且受熱不穩(wěn)定；②大量滅活的Tp免疫后顯示保護性免疫發(fā)展緩慢，這可能是Tp外膜蛋白缺乏而需要對這些抗原進行重復(fù)免疫；③Tp免疫接種對外源的Tp菌株無交叉保護作用，表明不同菌株的保護性抗原不同；④滅活Tp保護時間長且感染后菌液量減少，說明在兔模型中可以獲得有效的免疫保護。

已有大量文獻證實個別抗原在動物模型的免疫接種中具有一定的保護能力，包括Tp92 (BamA)、TprK、Gpd、TmpB、Tp0751和FlaB3[23-27]。其中Tp92 (BamA)、Gpd和FlaB3免疫的新西蘭兔表現(xiàn)出延緩感染部位皮損發(fā)展的部分性保護作用[25,27]。而且TprK蛋白分子的保護性區(qū)域定位于N端，有望獲得部分性免疫保護[28]。但是目前Tprk、Gpd、Tp92等幾種蛋白的保護能力存在不確定性，主要表現(xiàn)為實驗室條件的差異性，需要抗原制備和免疫方法標準化。而且這些重組抗原的免疫原性往往較差，不能誘導完全保護所需的免疫應(yīng)答類型，限制了其在臨床上的應(yīng)用。但是這些研究在全新的方向上為新型疫苗的研制提供了選擇。

4 Tp疫苗研制所需要的遞送系統(tǒng)

Tp感染期間，原發(fā)和繼發(fā)病灶的消退與T細胞和巨噬細胞為主的炎性細胞浸潤過程一致[29-30]。人體的原發(fā)性病變及兔子的原發(fā)性和繼發(fā)性病變主要包含CD4+T細胞、巨噬細胞和NK細胞，而人體繼發(fā)性病變炎性細胞浸潤以CD8+T細胞為主[31-32]。大量的文獻證實遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity, DTH)參與了病灶部位的Tp清除[33]。這種DTH清除機制主要依靠Th1型細胞因子(IFN-γ、IL-2和IL-12)[34-35]。其中感染部位的IFN-γ主要是由CD4+T細胞、NK細胞、CD8+T細胞和定植的樹突細胞分泌[36-37]。隨后Th1型細胞因子誘導的巨噬細胞活化并促進調(diào)理素吞噬Tp。各種數(shù)據(jù)顯示，Tp感染部位皮損的DTH和心腦血管并發(fā)癥的出現(xiàn)與宿主過強的Th1型細胞炎癥應(yīng)答密切相關(guān)[33-34]。由此說明維持炎癥細胞因子和抗炎癥細胞因子之間的動態(tài)平衡對Tp感染至關(guān)重要。一旦免疫應(yīng)答之間的平衡被打破，可導致Tp慢性感染或者病情加重。因此，在決定Tp疫苗研究的候選抗原方面，調(diào)控Tp感染的免疫應(yīng)答與誘導有效的抗Tp免疫同樣重要。在Tp疫苗研究的動物模型中，無論是體液成分的被動免疫，還是T細胞過繼轉(zhuǎn)移都不能產(chǎn)生完全性的免疫保護[38-39]。此外，人或兔腹膜巨噬細胞吞噬Tp取決于患者免疫血清或兔免疫血清也凸顯出體液成分在有效清除Tp所需的細胞誘導免疫反應(yīng)的重要性[31,36]。這些都表明Tp感染清除過程中細胞誘導的免疫反應(yīng)與體液應(yīng)答的相互作用是必不可少的[40]。因此需要對調(diào)理素抗體敏感度相關(guān)的特定表面抗原暴露或表面抗原的多樣性進行鑒別，因為持續(xù)存在的Tp人群的特性難以捉摸，使完全免疫清除Tp的疫苗方案無法實行。

大量文獻指出Tp致病機制的關(guān)鍵是血液播散。相對于皮損部位的免疫應(yīng)答，目前系統(tǒng)感染的免疫應(yīng)答認識還不很明確[13]。Tp感染期間，外周血細胞中的樹突細胞、分泌IFN-γ和細胞毒性的NK細胞促使淋巴細胞聚集到二次感染部位，患者血清中主要為Th1型細胞因子(IFN-γ和IL-10)，而Tp感染未經(jīng)治療的患者血清中主要為低水平的Th2型細胞因子(IL-4和IL-5)[37,40]。由此表明，抗Tp保護性免疫有賴于Th1和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡。同時在潛伏期內(nèi)，患者血清中IL-17和IL-23水平均升高，提示潛伏期內(nèi)Tp也可能引起一系列的免疫反應(yīng)[37,40]。這些結(jié)果可能源于研究方法的不同，以及對血清細胞因子水平與特定細胞類型的細胞因子分泌有關(guān)。除協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答允許合適的免疫細胞聚集在感染部位之外，系統(tǒng)的免疫應(yīng)答還可促進血液中細胞因子對Tp的識別與清除[40]。因此防止Tp播散到遠端器官取決于候選疫苗的抗體能否識別血源性傳播過程中表達的Tp蛋白。

5 Tp疫苗開發(fā)策略

從Tp的自然發(fā)展歷程中可以預(yù)測研制疫苗的最優(yōu)策略。Tp早期感染的典型表現(xiàn)主要為感染部位的潰瘍性病變(硬下疳)，繼之以播散性皮疹和黏膜病變?yōu)橹鱗14]。由于Tp的傳播是通過接觸感染的原發(fā)性硬下疳或繼發(fā)性病變而發(fā)生，因此預(yù)防或減弱這些病變將是Tp疫苗研究的必要條件，它將有助于消除或減少人與人之間的傳播。Tp疫苗研究的第2個關(guān)鍵因素是針對Tp在感染宿主體內(nèi)的播散。高度侵襲性的Tp能穿過胎盤屏障引起先天性梅毒，穿過血管屏障引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[41]。動物研究表明Tp感染數(shù)小時內(nèi)就出現(xiàn)血液和淋巴管播散[42]。目前臨床前疫苗研究的目標應(yīng)該是候選抗原能誘導DTH，促進Th1細胞因子的產(chǎn)生，并激活巨噬細胞，加速Tp的調(diào)理吞噬[33]。因此，有效的疫苗接種還需要關(guān)注Tp的持續(xù)性感染，抑制血管內(nèi)Tp向遠端組織擴散[26,32]。Tp外膜蛋白Tp0751是一種黏附素，可針對性黏附到血管系統(tǒng)內(nèi)的多種宿主成分，可能在Tp擴散中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[43]。Lithgow等人也證實Tp0751可以作為一個理想的疫苗候選抗原抑制Tp在宿主體內(nèi)的擴散[26]。通常原核生物如細菌、支原體、衣原體和螺旋體等存在較多的血清型，容易發(fā)生交叉反應(yīng)，因此在疫苗研究中通常會采用多價疫苗使宿主獲得完全保護。所以臨床前Tp疫苗開發(fā)進程中，需要評估幾個關(guān)鍵問題：①實現(xiàn)最大免疫效果所需的疫苗接種次數(shù)；②接種疫苗后誘導免疫持續(xù)的時間；③對不同菌株的交叉保護；④合適的多價疫苗制備；⑤佐劑選擇和優(yōu)化，以實現(xiàn)對Tp感染有效保護的免疫應(yīng)答。

6 展望

至今為止，盡管Tp疫苗研制的條件有限，隨著資金和監(jiān)管機構(gòu)的介入，該領(lǐng)域有望在未來5年內(nèi)取得顯著進展?，F(xiàn)代研究工具的應(yīng)用，對Tp的生物學研究加深了我們對其致病機制的了解，并發(fā)現(xiàn)新的候選疫苗。跨學科研究考慮宿主與病原體兩方面的相互作用，包括宿主對感染的先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，以及Tp相關(guān)的逃避機制，將增加對與預(yù)防疾病相關(guān)關(guān)系的了解。目前存在一種能夠包含大多數(shù)疾病極好的動物模型，因此可以進行臨床前研究，這將為隨后的人類Ⅰ期臨床疫苗試驗提供幫助?？傊?，將這些研究成果和方法應(yīng)用于Tp研究，將推動Tp疫苗研制的發(fā)展。