黃曙 周海浪 王敏 范志寧

1漣水縣人民醫(yī)院消化科，淮安 223400；2江蘇省人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心，南京 210029

klotho是1997年發(fā)現(xiàn)與衰老相關(guān)的基因[1]。近年來一些研究表明klotho還與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、肝細(xì)胞癌等[2-6]。Abranovitz等[7]報道，胰腺癌中klotho可以通過抑制胰島素和類胰島素生長因子-1(IGF-1)以及成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)信號通路發(fā)揮腫瘤抑制物的作用。本研究檢測胰腺癌組織和血清klotho的表達(dá)水平，分析其與胰腺癌病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系，探討klotho作為胰腺癌腫瘤分子標(biāo)志物的臨床意義。

材料與方法

一、胰腺癌組織芯片

包含79例胰腺癌組織及其配對的癌旁正常胰腺組織的組織芯片由上海芯超生物技術(shù)有限公司提供(編號OD-CT-DgPan01-006)，每片芯片的完整性>95%。79例者中男性47例，女性32例，年齡37～76歲，平均59歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期，Ⅰ期35例，Ⅱ期9例，Ⅲ期35例。術(shù)后起一直隨訪至患者腫瘤復(fù)發(fā)死亡為止，隨訪時間2～61個月，平均27個月。

二、胰腺組織klotho蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測組織芯片中klotho蛋白的表達(dá)，嚴(yán)格按照說明書操作。山羊抗人klotho多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，工作濃度為1∶100，以細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。根據(jù)染色強度與陽性細(xì)胞數(shù)綜合計分。染色強度：無染色、淡黃色、棕黃色、褐色分別計1、2、3、4分；陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：<25%、25%～<50%、50%～<75%、≥75%分別計1、2、3、4分。兩分相乘即為總分，≤4分為陰性， >4分為陽性。

三、患者血清klotho水平測定

收集2016年1月至2017年12月間漣水人民醫(yī)院住院的39例胰腺癌患者血清，同時采集39例與其臨床資料相匹配的健康者血清作為對照組。采用ELISA法檢測血清分泌型klotho蛋白水平，試劑盒購于日本Immuo-Biological Lab公司。測定的最低值為6.15 pg/ml，批內(nèi)和批間變異系數(shù)為2.7%～9.8%。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌組織klotho蛋白陽性表達(dá)率及其與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胰腺癌組織klotho表達(dá)陽性率為59.5%(47/79)，癌旁組織陽性率為96.3%(77/80)，胰腺癌組織陽性率明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=31.282，P<0.001，圖1)。胰腺癌組織klotho的蛋白表達(dá)與胰腺癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān), 而與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、局部侵潤深度等無相關(guān)性(表1)。

二、胰腺癌組織klotho表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

胰腺癌klotho蛋白陽性表達(dá)與患者預(yù)后呈正相關(guān)，klotho蛋白陽性及陰性患者組的中位生存期分別為(48.31±6.94)個月(95%CI34.710～ 61.909)、(19.50±6.78)個月(95%CI6.206～ 32.794，圖2)，陽性組顯著長于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 胰腺癌組織(1A)及癌旁正常組織(1B)的klotho蛋白表達(dá)(HE ×400)

臨床病理資料例數(shù)klotho的表達(dá)情況陽性(%)陰性χ2值P值年齡(歲) ≥603823(50.0)150.0740.786 <604023(64.3)17性別 女3219(59.4)130.0000.986 男4728(59.6)19腫瘤大小(cm) ≤45231(59.6)210.2720.976 >42715(59.3)13腫瘤位置 胰腺頭部5131(60.8)292.1690.765 胰腺體部52(40.0)3 胰腺頸部和體部11(100.0)0 胰腺體部和尾部137(53.8)6 胰腺尾部43(75.0)1 胰腺頭部至尾部42(50.0)2TNM分期 Ⅰ期3526(74.3)95.8530.047 Ⅱ期95(55.6)4 Ⅲ期3516(45.7)19淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況 無3929(74.4)105.7260.017 有3416(47.1)18浸潤深度 T132(66.7)10.3130.940 T26740(59.7)27 T395(55.6)4

圖2 胰腺癌klotho蛋白表達(dá)陽性及陰性患者的術(shù)后生存期

三、胰腺癌患者血清klotho水平

胰腺癌組、對照組外周血清klotho水平分別為(670.30±82.24) 、(310.35±34.65)pg/ml，胰腺癌組顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=25.5，P<0.001)。通過對影響受試者和對照組血清klotho水平的潛在混雜因素分析，表明差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)，提示檢測結(jié)果可靠。

表2 影響胰腺癌患者血清klotho表達(dá)的潛在因素

繪制klotho水平的ROC曲線，其曲線下的面積為0.859，臨界診斷值為376.51 pg/ml(圖3)。診斷胰腺癌的敏感度為84.6%，特異度為87.2%。

圖3 胰腺癌患者血清klotho水平的ROC曲線

klotho基因于1997年被發(fā)現(xiàn)[1]，最先的研究認(rèn)為它是一種抗衰老基因，因klotho基因敲除的小鼠出現(xiàn)了過快衰老的癥狀，如骨質(zhì)疏松、皮膚萎縮、動脈硬化等，且生存期明顯縮短，而klotho基因高表達(dá)的小鼠則表現(xiàn)為生存時間延長[8]。近年來對klotho基因的功能研究提示其與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展亦密切相關(guān)。klotho能抑制多種惡性腫瘤相關(guān)信號通路如insulin/IGF-1、Wnt/β-catenin、TGF-1等，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長與遷移，這些結(jié)果在乳腺癌、肝癌、腎癌中得到證實[5, 7, 9-10]。但是Lu等[11]在卵巢上皮細(xì)胞癌中的研究結(jié)果卻提示klotho蛋白表達(dá)可能與卵巢癌進(jìn)展有關(guān)，而并非發(fā)揮抑癌因子樣作用，說明klotho基因在不同的腫瘤中可能發(fā)揮著不同的作用。

Abramovitz等[7]采用免疫組織化學(xué)法檢測了5例正常胰腺組織與18例胰腺癌組織klotho蛋白的表達(dá)，正常胰腺組織klotho表達(dá)陽性率為100%，顯著高于胰腺癌組織的17%；癌組織klotho mRNA表達(dá)也顯著低于癌旁組織。細(xì)胞模型的研究發(fā)現(xiàn)klotho基因可以通過抑制IGF-1/FGF通路發(fā)揮抑癌基因的作用。本結(jié)果顯示，胰腺癌組織klotho蛋白表達(dá)陽性率明顯低于癌旁組織，胰腺癌組織klotho蛋白表達(dá)與胰腺癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān),胰腺癌組織klotho表達(dá)陽性患者的生存期明顯長于klotho表達(dá)陰性的患者。

目前可以通過ELISA法檢測人血中分泌型klotho蛋白，且試劑盒已商業(yè)化，如通過測定腎病、糖尿病患者與健康老人血清分泌型klotho蛋白的水平，分析分泌型klotho蛋白相應(yīng)的臨床意義[12-14]。本研究也使用ELISA法檢測了胰腺癌與其匹配對照組血清分泌型klotho水平，結(jié)果顯示胰腺癌患者血清分泌型klotho水平顯著高于對照組。結(jié)合klotho在胰腺癌組織中低表達(dá)的研究結(jié)果，似乎存在矛盾之處，推測其原因可能與胰腺癌的腫瘤微環(huán)境有關(guān)。因胰腺癌細(xì)胞周圍的間質(zhì)異常致密，可發(fā)揮“屏障”作用，使分泌型klotho蛋白不能接觸癌細(xì)胞，從而不能發(fā)揮其抑癌作用，進(jìn)而外周血中klotho濃度代償性升高，此種現(xiàn)象也見于肝癌[15]。通過ROC曲線分析，診斷胰腺癌的血清klotho的臨界值為376.51 pg/ml，敏感度為84.6%，特異度為87.2%，可以作為診斷胰腺癌及判斷預(yù)后的指標(biāo)之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突