侯鵬超 葉迅 魏燕 洪郁芝*

近年來糖尿病在我國的形式日益嚴(yán)峻，如何早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療成為糖尿病現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為糖尿病前期的糖代謝異常具有高度的可逆性，即給予該階段及時、合理、科學(xué)的干預(yù)措施，糖尿病前期可以逆轉(zhuǎn)為糖耐量正常。國外已有羅格列酮干預(yù)糖尿病前期的實(shí)驗(yàn)研究，但其存在心血管副作用、患者依從性差等狀況，較難適應(yīng)目前我國國情。芪山無糖顆粒是本院對糖尿病前期經(jīng)典方進(jìn)行有效成分提取、生產(chǎn)工藝優(yōu)選后制成的復(fù)方飲片顆粒劑。2013年3月至2014年9月作者通過大鼠動物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討芪山無糖顆粒劑干預(yù)糖尿病前期的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 4周齡雄性SPF級SD大鼠60只，體重（100±20）g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供［SCXK(滬)2013-0016］。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心［SCXK(浙)2008-0115］。溫度（20±2）℃，相對濕度50%～70%，12h/12h交替照明。芪山無糖顆粒配置自杭州市中醫(yī)院制劑中心，由黃芪、山藥、茯苓、黃連、絞股藍(lán)、炒枳殼、生山楂、川芎、葛根、蒼術(shù)配置而成，經(jīng)濃煎后提取上清液制作成顆粒劑，批號：130405；馬來酸羅格列酮購自英國GlaxoSmithKline公司；SOCS-3引物購買自生工生物工程(上海)股份有限公司；JAK2抗體購自美國Proteintech公司，STAT1抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法 （1）分組和建模：SD雄性大鼠通過長期的高糖高脂喂食制造糖尿病前期模型。取出生4周SD雄性大鼠60只，體重（100±20）g，普通飼料喂食2周適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分成6組：正常對照組（NC）、高脂對照組（MC）、 低劑量中藥組（Z1）、中劑量中藥組（Z2）、高劑量中藥組（Z3）、羅格列酮組（X）。每組10只，其中8只為實(shí)驗(yàn)用鼠，其余2只為備用。NC組采用大鼠普通飼料喂食，MC、Z1、Z2、Z3、X組采用大鼠高脂飼料喂食；16周后 MC、Z1、Z2、Z3、X比NC的體重和2hPG同時出現(xiàn)顯著增高（P＜0.01），糖尿病前期造模成功。（2）藥物干預(yù)：造模成功后，各組繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)同時，并予以藥物灌胃治療16周。NC、MC組采用蒸餾水2ml/d灌胃，Z1、Z2、Z3組分別使用中藥 1.5625g/（kg·d）（等同于人的用量）、3.125g/（kg·d）（等同于人用量的 2 倍）、6.25g/（kg·d）（等同于人用量的4倍)灌胃，X組采用羅格列酮0.833mg/（kg·d）（相當(dāng)于人的最大推薦劑量）灌胃。用藥16周后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后處死。（3）RT-PCR檢測大鼠肝臟SOCS-3基因表達(dá)。取大鼠肝臟組織用TRIzol提取RNA，并檢測RNA濃度。將相同濃度的RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，按照預(yù)設(shè)引物(見表1)實(shí)行PCR擴(kuò)增。β-action：94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 30s；共27個循環(huán)。SOCS-3：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s；共34個循環(huán)。最后進(jìn)行瓊脂糖電泳和分析。整個過程重復(fù)3次，最終確定SOCS-3的基因表達(dá)量。（4）Western Blot檢測大鼠胰腺JAK2、STAT1蛋白表達(dá)：取大鼠胰腺組織用RIPA裂解液提取蛋白，并檢測蛋白濃度。將相同濃度的蛋白進(jìn)行蛋白電泳，并完成轉(zhuǎn)膜。相應(yīng)加入JAK2、STAT1一抗和熒光二抗進(jìn)行孵育。最后在雙色熒光成像系統(tǒng)上進(jìn)行分析。整個過程重復(fù)3次，最終確定JAK2和STAT1的蛋白表達(dá)量。

表 1 PCR引物

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較使用方差分析，組間兩兩比較，方差齊時采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組體重和2hPG比較 見表2。

表 2 各組體重和2hPG比較（±s）

表 2 各組體重和2hPG比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.01

組別 n 基礎(chǔ)體重（g） 16周體重（g） 基礎(chǔ)2hPG（mmol/L）16周2hPG（mmol/L）NC 8 218.35±8.95 454.09±39.94 6.81±0.50 6.74±0.23 MC 8 217.46±19.54 543.96±69.05* 6.18±0.60 8.80±0.86*Z1 8 217.56±13.17 537.41±64.53* 6.68±0.80 9.21±0.85*Z2 8 224.11±9.91 539.00±40.06* 6.65±0.60 8.71±0.74*Z3 8 215.08±12.38 527.54±48.09* 6.58±0.89 8.68±0.78*X 8 218.81±13.47 529.99±53.12* 6.91±1.03 9.01±0.65*

2.2 各組SOCS-3基因表達(dá)比較 見表3。

表 3 各組SOCS-3基因表達(dá)（±s）

表 3 各組SOCS-3基因表達(dá)（±s）

注：與NC組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與MC組比較，▲P＜0.05；與Z兩組比較★P＜0.05

SOCS-3 NC 8 0.4698±0.1694 MC 8 1.6731±0.1796△△Z1 8 1.4945±0.3093△△Z2 8 1.0324±0.1933△△▲Z3 8 0.7363±0.099△▲★X 8 0.7275±0.1052△▲★n

2.3 各組JAK2、STAT1表達(dá)比較 見表4。

表4 各組JAK2、STAT1表達(dá)比較（±s）

表4 各組JAK2、STAT1表達(dá)比較（±s）

注：與NC組比較，△P＜0.05；與MC組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與Z1組比較■P＜0.05，■■P＜0.01；與Z兩組比較★P＜0.05，★★P＜0.01；與Z3比較，#P＜0.05

8 1.334±0.2075▲▲■■★# 1.2755±0.0714△▲▲■■★★JAK2 STAT1 NC 8 1.408±0.2983 1.6946±0.1325 MC 8 0.4874±0.1639△ 0.4073±0.2172△Z1 8 0.7469±0.2043△▲ 0.857±0.1842△▲▲Z2 8 0.953±0.1364△▲▲■ 1.0368±0.1836△▲▲■Z3 8 1.0788±0.0897△▲▲■■ 0.7217±0.1826△▲▲★★X n

3 討論

2型糖尿病大鼠動物模型建立已有較為成熟建模方法，一般采用小劑量左旋鏈脲菌素(STZ)20～30mg/kg腹腔注射破壞大鼠胰腺達(dá)到大鼠血糖升高，同時配合高脂飲食造成大鼠肥胖，兩者結(jié)合達(dá)到造模要求［1］。但目前缺乏糖尿病前期模型建立的相關(guān)文獻(xiàn)，而采用STZ建立糖尿病前期模型較難得到滿意的效果，STZ的胰腺破壞效果不穩(wěn)定，且與注射前大鼠空腹時間有密切的關(guān)系，空腹時間越長胰腺破壞程度越嚴(yán)重，常造成20～30mmol/L高血糖，無法符合糖尿病前期的造模要求；Ionut V認(rèn)為采用STZ建立的動物模型，是通過急性破壞胰腺，使胰腺功能急劇下降的情況下建立的，此時動物無肥胖和胰島素抵抗，這使建立的模型更像是1型糖尿病而非其他［2］。因此確立糖尿病前期新的造模標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)驗(yàn)成功的保證。Soares E對成年Wistar大鼠采用高糖飲食，9周后與普通飲食大鼠比較，高糖Wistar大鼠表現(xiàn)出體重及血糖升高并伴有高胰島素血癥，以此認(rèn)為糖尿病前期模型建立成功［3］。本實(shí)驗(yàn)采用同樣的思路，使用較Wistar大鼠血糖表現(xiàn)更為穩(wěn)定的SD大鼠，并通過更長時間(16周)的高糖高脂喂食，促使其體重和餐后2h血糖的同時升高（P＜0.01），以此確立糖尿病前期造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

本資料結(jié)果顯示，SOCS-3的基因表達(dá)隨著中藥濃度的增加出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01），其中以Z3組下降最為明顯，且與羅格列酮組的效果相當(dāng)（P＞0.05）。表明芪山無糖顆粒隨著藥物濃度的增加能顯著降低SOCS-3的基因表達(dá)，且與羅格列酮效果相似。JAK2蛋白的表達(dá)則隨著中藥濃度的增加出現(xiàn)不同程度的回升（P＜0.05或 0.01），其中 Z2、Z3組表現(xiàn)相當(dāng)（P＞0.05），但劣勢與羅格列酮組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而在STAT1蛋白表達(dá)上，中藥中Z兩組的表達(dá)最為明顯（P＜0.05），但仍劣于羅格列酮組的表現(xiàn)（P＜0.01）。表明芪山無糖顆粒能升高JAK2和STAT1蛋白的表達(dá)，但受到藥物濃度的影響并不明顯，且與羅格列酮存在差距。

JAK/STAT信號通路在糖尿病前期中有重要作用。目前認(rèn)為JAK/STAT信號通路是參與瘦素傳導(dǎo)的主要通路，瘦素能促使JAK2絡(luò)氨酸激酶的活化，從而促使STAT3、STAT5的激活，并最終導(dǎo)致增加胰島素的敏感性、降低血糖、抑制食欲、減輕體重［4］。有研究顯示在基因敲除的STAT3、STAT5小鼠中出現(xiàn)了明顯的攝食過量、肥胖、不孕等［5］。而糖尿病前期時，瘦素出現(xiàn)抵抗使其喪失對血糖的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而加速了1型和2型糖尿病的發(fā)生［6］。因此在藥物對糖尿病前期的干預(yù)過程中，JAK2、STAT3、STAT5指標(biāo)的表達(dá)恢復(fù)可以認(rèn)為治療有效的標(biāo)志。本資料中，芪山無糖顆粒干預(yù)后JAK2蛋白出現(xiàn)了明顯回升（P＜0.05或0.01），雖然和羅格列酮的治療效果尚存在一定的差距（P＜0.05），但已經(jīng)可以證明芪山無糖顆?？梢阅孓D(zhuǎn)JAK2蛋白的表達(dá)，有效干預(yù)糖尿病前期的進(jìn)展。同時STAT1指標(biāo)也出現(xiàn)了恢復(fù)（P＜0.01），同樣證明芪山無糖顆粒對STAT家族的恢復(fù)作用。

SOCS家族是JAK/STAT信號通路的上游抑制因子，其一些成員參與胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［7］。目前認(rèn)為胰島素、瘦素、生長激素等可誘導(dǎo)SOCS-3的基因表達(dá)，而其表達(dá)產(chǎn)物又可阻止這些細(xì)胞因子信號的傳導(dǎo)［8］。Peralta S研究證明，在胰島素抵抗及瘦素抵抗的Sprauge-Dawley大鼠下丘腦中，SOCS-3的基因表達(dá)水平增加，而實(shí)施飲食控制后，SOCS-3基因表達(dá)得到控制，提示SOCS-3參與胰島素抵抗及瘦素抵抗［9］。因此在糖尿病前期中，SOCS-3可能出現(xiàn)表達(dá)增加，從而抑制JAK/STAT信號通路限制JAK2、STAT的表達(dá)。因此使用藥物對糖尿病前期進(jìn)行干預(yù)，SOCS-3表達(dá)減少認(rèn)為治療有效。本資料中，芪山無糖顆粒干預(yù)后SOCS-3基因表達(dá)迅速出現(xiàn)回落（P＜0.05或＜0.01），其在大劑量藥物干預(yù)的過程中表現(xiàn)出和羅格列酮相同的效果，表明芪山無糖顆粒可以降低SOCS-3基因表達(dá)，改善糖尿病前期。

綜上所述，芪山無糖顆粒能逆轉(zhuǎn)糖尿病前期大鼠SOCS-3基因及JAK2、STAT1蛋白表達(dá)，證實(shí)其在早期延緩糖尿病的發(fā)生發(fā)展有著重要作用，為進(jìn)一步探討芪山無糖顆粒劑干預(yù)糖尿病前期的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，為探索適合我國國情糖尿病前期的干預(yù)方法提供中藥學(xué)依據(jù)。但其對SOCS以及STAT其他家族成員是否具有同樣作用尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。