方宗潮 童曄玲 王楠楠 王昱霽 蔡婷婷 朱婉萍*

紅豆杉，又名紫杉，是紅豆杉科紅豆杉屬植物，Wani等最早從短葉紅豆杉Taxus brevifolia中分離得到紫杉醇（Taxol）［1］，并證實其具有顯著的抗腫瘤活性。近年來研究表明，紅豆杉具有解熱鎮(zhèn)痛［2-3］，抗炎，降低血糖，抗氧化，抗自由基作用，能提高免疫調節(jié)能力［4］。紅豆杉植物中的紫杉醇屬于二萜類化合物。紅豆杉植物生物合成紫杉醇的最重要前體物質10-脫乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DABⅢ），也是二萜類紫杉烷衍生物，是目前半合成生產紫杉醇或多烯紫杉醇的主要原料。故10-DABⅢ常與紫杉醇一起被研究［5］。2017年12月至2018年6月作者通過實驗研究，以紅豆杉枝葉為原材料，先進行簡單的樣品前處理，利用高速逆流分離純化10-DABⅢ類和紫杉醇類部位化合物，篩選最佳的分離系統(tǒng)。并對兩個部位化合物的抗炎活性進行初步篩選研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 TBE-300A型高速逆流色譜儀（內徑1.6mm，柱容積300 ml，上海同田生化技術有限公司）；Waters-1525-2489高效液相色譜儀（美國Waters公司）；SB-5200DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；BUCHI R-210型旋轉蒸發(fā)儀；電子分析天平（Meittler Toledo MS204上海有限公司）；Sartorius 611UV反滲透純水機。3111型 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；GS-6R離心機（Beckman 公司）；HR40-Ⅱ-A2 型醫(yī)用凈化工作臺（青島海爾特種電器有限公司）；CK40-F200型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；Power Wave-XS全波長酶標儀（美國BioTek公司）。

1.2 試劑 正己烷（分析純，成都科隆化學品有限公司，批號2018051501）乙酸乙酯（分析純，成都科隆化學品有限公司，2018071001）甲醇（分析純，成都科隆化學品有限公司，2018081301）；乙醇（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司，20160106）；10-DABⅢ標準品（上海金山生物技術有限公司，批號20050509）；紫杉醇標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號100382-200301）；CCK-8試劑（DOJINDO Laboratories，日本，批號LA779）；脂多糖（Sigma公司，S11060）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號20170612）；DMEM高糖培養(yǎng)基（1X）（吉諾生物科技醫(yī)藥技術有限公司，批號1805100106）；PBS（1X）（吉諾生物科技醫(yī)藥技術有限公司，批號1808040107）；ELISA 試劑盒（聯(lián)科生物有限公司，批號 A310H81045）水為蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.3 細胞株 細胞株為小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞株（中國科學院細胞庫），本實驗室液氮保存。

1.4 中藥飲片 南方紅豆杉枝葉購買于寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司，批號為20161008。

1.5 實驗方法 （1）紅豆杉枝葉粗提物的制備：將紅豆杉枝葉除雜打粉，過六號篩，稱取15g紅豆杉粉末，采用超臨界CO2萃取，萃取溫度35℃，分離溫度40℃，壓力250bar，物料與夾帶劑的比例為1：3，靜態(tài)萃取0.5h，動態(tài)萃取2h。將超臨界CO2得到的浸膏，經過石油醚/水層和二氯甲烷/水層萃取至水層無顏色，將二氯甲烷層收集旋干，靜置，用于后續(xù)高速逆流分離實驗。經檢測紅豆杉枝葉粗提物中10-DABⅢ的含量是8.70%，紫杉醇的含量是3.21%。（2）高速逆流分離：通過查閱文獻［6］了解待分離物質的理化性質，如溶解度、極性、穩(wěn)定性等，方便尋找合適的分離系統(tǒng)。粗提物易溶于氯仿、二氯甲烷和醋酸乙酯等溶劑，石油醚、正己烷等溶劑中難溶，可采用中等極性的分離系統(tǒng)對化合物進行分離純化。本實驗以文獻［6］的溶劑條件篩選模型為指導原則，在參考文獻［7］報道的（正己烷-醋酸乙酯-甲醇-乙醇-水=5∶7∶5∶1∶6.5，流動相流速為2ml/min）分離系統(tǒng)基礎上，對流動相流速和溶劑中的正己烷、乙酸乙酯和甲醇的比例進行調整（見表1），通過觀察色譜圖的峰型變化篩選最佳分離系統(tǒng)。本實驗所選擇的分離系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-乙醇-水，分別按不同比例配制溶劑于分液漏斗中，充分振蕩使其混合均勻并于室溫靜置24h。待兩相溶劑分層后分別取出上、下兩相（上相和下相分別為固定相和流動相），并于25℃超聲脫氣10 min，備用。取粗提物1g加入上相10ml，超聲10min，使其助溶，過濾除去不溶物，即制備得樣品溶液。（3）HSCCC分離與化合物的鑒定：將上相（固定相）首先泵入HSCCC儀主機，體積流量30ml/min，待有液體溢出后，再以2ml/min的體積流量泵入下相（流動相），同時開啟HSCCC儀主機，設置轉速為900r/min，檢測波長254nm，達到動力學平衡后，將溶解后的樣品溶液10ml注入HSCCC儀，結合HSCCC色譜儀檢測，棄掉前面雜峰，將相同的流分合并。在35℃下減壓回收溶劑，旋干溶劑，收集化合物。以石油醚（Pe）和乙酸乙酯（Ea）為展開劑，通過薄層色譜法與HPLC法鑒定化合物及其含量。（4）HPLC檢測10-DABⅢ和紫杉醇的含量：色譜柱：CAPCELL PAK C18（5μm，250×4.6mm），0～20min， 乙 腈 ：水=50：50等度洗脫，流速1ml/min，柱溫30℃，檢測波長227nm，分析時間20min，進樣量10μl。（5）化合物抗炎活性篩選：將2個化合物分別用二甲基亞砜（DMSO）溶解，分別配制為200mg/ml的母液，放置-20℃下凍存?zhèn)溆茫R用時用培養(yǎng)液稀釋。巨噬細胞RAW264.7采用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100u/ml、鏈霉素100μ/ml）置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據細胞生長狀態(tài)，換培養(yǎng)液1次/2d。（6）不同化合物對RAW264.7細胞毒性考察：取對數細胞生長的巨噬細胞RAW264.7以1×105個/孔鋪在96孔板上，100μl/孔，培養(yǎng)24h。設置以下組別：正常對照組、DMSO組、化合物1組（200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml）、化合物兩組（200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml）， 培 養(yǎng) 48h， 移除培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑，37℃繼續(xù)孵育1h后，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液。振搖均勻后，用酶標儀在450nm 處測定各孔的吸光度。計算巨噬細胞的存活率。（7）IL-10測定： 根據2.4.2的方法培養(yǎng)細胞，根據2.4.3方法下設置細胞組別，取對數細胞生長期的巨噬細胞RAW264.7以每孔1×105個/ml接種于24孔板，0.5ml/孔，培養(yǎng)24h后，加入1μg/ml LPS培養(yǎng)24h，加入不同濃度藥物24h后，收集上清液。根據ELISA試劑盒方法，用酶標儀在450nm 處測定各孔的吸光度。

表1 不同分離系統(tǒng)中（正己烷，乙酸乙酯，甲醇）溶劑比例

2 結果

2.1 分離系統(tǒng)篩選 見圖1～4。

圖1 HSCCC色譜圖

圖2 HSCCC色譜圖

圖3 HSCCC色譜圖

圖4 HSCCC色譜圖

2.2 化合物鑒定 薄層色譜法與HPLC鑒定并檢測兩個化合物中10-DABⅢ和紫杉醇的含量，采用展開劑（Pe：Ea=1：2）對化合物進行展開，對照標準品色譜相應的位置上，化合物顯相同顏色的斑點，薄層色譜圖譜表明化合物1含有10-DABⅢ，化合物2含有紫杉醇。HPLC法測定化合物1中10-DABⅢ的含量為41.32%，化合物2中紫杉醇的含量為48.70%，見圖5。經過高速逆流色譜分離，粗提物中10-DABⅢ的含量從8.70%增至41.32%，紫杉醇的含量從3.21%增至48.70%。高速逆流色譜有效富集浸膏中兩種紫杉烷類化合物。

圖5 高效液相色譜圖

2.3 化合物對巨噬細胞RAW264.7毒性考察 不同濃度化合物組與對照組比較，化合物1和化合物2在3.125μg/ml～12μg/ml范圍濃度作用于RAW264.7細胞24h對細胞存活率無差異，對細胞無毒性影響，化合物 1和化合物 2在 100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml濃度下巨噬細胞存活率均明顯低于正常對照組，表示兩種紫杉烷類化合物均抑制巨噬細胞存活率。故后續(xù)實驗紫杉烷類化合物濃度應＜12.5μg/ml。見圖6。

圖7 2個化合物對巨噬細胞RAW264．7存活率的影響（n=3）

2.4 化合物對LPS誘導的巨噬細胞表達IL-10的影響 與空白組比較，在LPS的刺激下RAW264.7細胞的IL-10分泌量顯著降低。與模型組比較，用地塞米松作用于RAW264.7細胞，IL-10的分泌量顯著增加。12.5μg/ml化合物1組作用于RAW264.7細胞，IL-10有明顯增加趨勢，6.25、3.125μg/ml的化合物l作用于RAW264.7細胞，與模型組差異并不顯著；用12.5、6.25、3.125μg/ml的化合物2處理 RAW264.7細胞，IL-10的含量與模型組差異不明顯。由此可知，紫杉烷類化合物中具有抗炎活性作用的為10-DABⅢ部位化合物。見圖7。

圖7 2個化合物對巨噬細胞RAW264．7分泌IL-10(pg/ml)的情況

3 討論

目前，紅豆杉活性化合物研究的最主要內容為紫杉烷類化合物，其中10-DABⅢ和紫杉醇的研究內容主要是關于兩種單體成分的分離提取，尚無關于兩種紫杉烷類部位化合物的分離，本實驗在文獻報道的基礎上調整分離系統(tǒng)，通過高速逆流色譜法的純化富集，兩種部位化合物的含量得到較大的提升。充分應用高速逆流的分離功能，對純化紫杉烷類化合物有較大的幫助。目前極性相近部位采用的分離純化方法主要是硅膠柱分離和制備液相純化，高速逆流色譜（HSCCC）是不需要固態(tài)載體的液-液分配色譜技術，相對于傳統(tǒng)的柱色譜法克服固相載體對樣品造成的吸附損失、變性、耗時長、固定相填料消耗量大、分離效率低的缺點。高速逆流不僅進樣量大，可多次循環(huán)進樣，而且操作簡單方便，分離周期短。因此，此方法可有效地用于極性相近部位大量化合物的分離?，F代中藥關于有效部位分離的研究越來越重視，優(yōu)化針對有效部位的分離純化技術，結合細胞模型的藥效篩選，能更加明確中藥有效部位，便于中藥藥效作用靶點研究，及相關有效成分的分析，為后續(xù)中藥有效部位研究奠定基礎。