陳娟，耿琳琳，盧文紅，張蔚，高麗娜，李琳

(國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081)

近年來(lái)不孕不育癥患者呈逐年增加的趨勢(shì)，已成為影響人類發(fā)展與健康的一個(gè)全球性醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)問(wèn)題。我國(guó)育齡人群中的不孕不育發(fā)生率已上升至10%～15%[1]，男性不育占其中的30%～40%[2]。隨著冷凍生物學(xué)和輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，供精人工授精(AID)和供精體外受精(IVF-D)作為人類輔助生殖技術(shù)之一，成為治療男性不育癥，尤其是無(wú)精子癥的重要治療手段[3]。精子優(yōu)選技術(shù)作為AID和IVF-D等輔助生殖技術(shù)的主要環(huán)節(jié)之一，與妊娠結(jié)局有著密切的聯(lián)系。目前常用的精子優(yōu)選方法包括，洗滌法(simple washing，SW)、密度梯度離心法(density-gradient centrifugation，DGC)、上游法(swim-up，SU)及磁性活性細(xì)胞分選法(magnetic activated cell sorting，MACS)。本文通過(guò)比較SW、DGC、SU和MACS四種方法對(duì)冷凍精液的優(yōu)選效果，旨在探討不同精液處理方法對(duì)冷凍精液的優(yōu)選效果，為AID和IVF-D提供可靠的數(shù)據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象及試劑、儀器

1.研究對(duì)象：收集本中心健康男性志愿者精液標(biāo)本，并簽署知情同意書(shū)。精液入選條件：精液液化時(shí)間正常，精液質(zhì)量符合WHO第5版手冊(cè)正常精液標(biāo)準(zhǔn)。

2.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：miniMACSstartingkit和Dead cellremovalkit購(gòu)于德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司；QUINNS Sperm Wash Medium(ART-1006)、PureCeption 24-Determination Bi-Layer Kit(ART-2024)購(gòu)于秒泉儀器有限公司；精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒和精子活體染色(伊紅-苯胺黑染色法)試劑盒購(gòu)于博銳德生物科技有限公司；生物顯微鏡(奧林巴斯CX41，日本)；機(jī)械細(xì)胞分類計(jì)數(shù)器。

二、研究方法

1.冷凍精液標(biāo)本的制備：精液標(biāo)本液化，2體積標(biāo)本中加入1體積甘油-卵黃-檸檬酸鹽(GEYC)冷凍保護(hù)劑混勻后于30℃孵育10 min，分裝標(biāo)本，每份標(biāo)本不少于1 ml，于液氮面懸掛熏蒸10 min后投入液氮內(nèi)保存。

2. 分組：按照不同的精液優(yōu)選方法設(shè)立4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別是SW組、DGC組、SU組和MACS組，每組隨機(jī)使用20例冷凍精液標(biāo)本。對(duì)冷凍精液標(biāo)本進(jìn)行復(fù)溫解凍，記錄每份冷凍精液優(yōu)選處理前后的精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子活率、膜完整性、正常形態(tài)率及DNA碎片率。

3.精子優(yōu)選處理：冷凍精液標(biāo)本預(yù)處理：從液氮中提取冷凍精液標(biāo)本后立刻放入37℃水浴鍋內(nèi)10 min進(jìn)行解凍。

洗滌法(SW組)：取1 ml解凍精液標(biāo)本加入2 ml ART-1006混勻后300g離心5 min，吸取并丟棄上清液，加入0.5 ml ART-1006重懸精子沉淀。置37℃溫箱內(nèi)備用。

直接上游法(SU組)：取1 ml解凍精液標(biāo)本置于15 ml無(wú)菌錐形離心管中，在精液上方加入1.2 ml培養(yǎng)液形成液層，離心管傾斜45度，放置37℃溫箱內(nèi)孵育1 h后保留上層培養(yǎng)液，300g離心5 min后丟棄上清液，加入0.5 ml ART-1006重懸精子沉淀。置37℃溫箱內(nèi)備用。

非連續(xù)密度梯度法(DGC組)：在15 ml無(wú)菌錐形離心管中制備密度梯度液，用ART-2024制備密度梯度分離液，下層為1 ml 80% Isolate，上層為1 ml 40% Isolate。取1 ml解凍精液緩慢加入密度梯度液上層，300g離心20 min，保留下層精子團(tuán)，加入2 ml ART-1006洗滌后300g離心5 min，吸取并丟棄上清液，加入0.5 ml ART-1006重懸精子沉淀。置37℃溫箱內(nèi)備用。

磁珠活性細(xì)胞分選法(MACS組)：取1 ml解凍精液，加入80 μl 1×結(jié)合緩沖液(每10×106個(gè)精子)和20 μl MACS AnnexinV磁珠(每10×106個(gè)精子)混勻室溫孵育15 min，加入2 ml ART-1006洗滌，300g離心5 min后去上清，用0.5 ml 1×結(jié)合緩沖液重懸，將精子懸液置于磁場(chǎng)分選柱中，結(jié)合AnnexinV磁珠的精子被滯留在分選柱中，AnnexinV陰性精子則順柱流出，用0.5 ml 1×結(jié)合緩沖液沖洗分選柱，重復(fù)3次，收集AnnexinV陰性精子和沖洗液于15 ml無(wú)菌錐形離心管，300g離心5 min，棄上清液，加入0.5 ml ART-1006重懸精子沉淀。置37℃溫箱內(nèi)備用。

4.精液動(dòng)態(tài)學(xué)檢測(cè)：在高倍鏡下按照前向運(yùn)動(dòng)、非前向運(yùn)動(dòng)和不活動(dòng)對(duì)精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，每份精液至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子，重復(fù)兩次，計(jì)算精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子活率。

5.精子形態(tài)學(xué)檢測(cè)：用巴氏染色法對(duì)精子進(jìn)行涂片染色，鏡下觀察200個(gè)精子，按WHO第5版手冊(cè)方法對(duì)精子進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查分類，計(jì)算精子總畸形率。

6.精子細(xì)胞膜完整性檢測(cè)：利用精子活體染色法(伊紅-苯胺黑染色法)對(duì)精子進(jìn)行涂片染色，鏡下觀察200個(gè)精子，判斷精子細(xì)胞膜是否完整，計(jì)算精子細(xì)胞膜完整率。如圖1所示，精子若細(xì)胞膜不完整，則被染為紅色。否則不著色或被染為淺粉色。

L為細(xì)胞膜完整精子(頭部為不著色或淡粉色)，D為細(xì)胞膜不完整精子(頭部被染為紅色)圖1 精子活性染色(細(xì)胞膜完整性檢測(cè))判斷示意圖

7.精子DNA完整性檢測(cè)：取60 μl待測(cè)精液標(biāo)本制備精子熔凝膠，制片后室溫放置醋酸溶液(含有0.09%過(guò)氧化氫)7 min后移入Tris-HCl緩沖液(含有0.5%十二烷基硫酸鈉SDS)25 min進(jìn)行裂解變性反應(yīng)，大量純化水洗滌后，依次用70%、90%、100%乙醇各洗滌2 min，干燥后用瑞士染液進(jìn)行染色。高倍鏡下觀察500個(gè)精子，如圖2所示，精子頭部?jī)H產(chǎn)生較小或者沒(méi)有光暈的即為含有DNA碎片的精子，計(jì)算精子DNA完整率。

①：精子DNA碎片判定圖示，其中A為精子頭部最小直徑，B為單側(cè)光暈厚度，當(dāng)B≤1/3A則表明精子存在DNA碎片；②、③：DNA完整的精子；④、⑤：存在DNA碎片的精子圖2 精子DNA完整性判斷示意圖

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、不同優(yōu)選方法前后精子回收率及前向運(yùn)動(dòng)活動(dòng)力參數(shù)變化比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，精子總數(shù)變化方面，4種優(yōu)選方法前后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中SU組冷凍精子優(yōu)選前后精子總數(shù)變化最大，回收率最低(SW組回收率56.13%，DGC組回收率33.04%，SU組回收率16.77%，MACS組回收率62.87%)。前向運(yùn)動(dòng)精子活率方面，DGC和SU組優(yōu)選后精液的前向運(yùn)動(dòng)精子活率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組優(yōu)選前后精子總數(shù)及前向運(yùn)動(dòng)精子活率比較(-±s)

注：與同組該指標(biāo)優(yōu)選前比較，*P<0.05

二、各組精子優(yōu)選前后形態(tài)學(xué)變化

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，SW組精液優(yōu)選前后精子膜完整性、正常形態(tài)率及DNA完整率，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；DGC、SU和MACS組，優(yōu)選后精子膜完整率、正常形態(tài)率及DNA完整率均顯著高于優(yōu)選前，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。瑞士染色結(jié)果表明，4種優(yōu)選方法中，MACS在DNA完整率的優(yōu)化上更加顯著，優(yōu)選前后數(shù)值為(69.79±3.90)%、(91.95±2.82)%(圖3)。

表2 優(yōu)選前后精子各項(xiàng)形態(tài)參數(shù)對(duì)比(-±s)

注：與同組該指標(biāo)優(yōu)選前相比，*P<0.05

1：優(yōu)選前；2：SW組；3：DGC組；4：SU組；5：MACS組圖3 優(yōu)選前后精子SCD實(shí)驗(yàn)圖片(瑞士染色，×40)

討 論

AID和供精I(xiàn)VF-ET作為治療男性不育癥，尤其是無(wú)精子癥的重要治療手段，所采用的精液均是經(jīng)低溫冷凍的精液。新鮮精液經(jīng)低溫冷凍后細(xì)胞完整性及DNA完整性均受到一定程度的損傷[4-5]，對(duì)優(yōu)胚率、種植率及妊娠率造成負(fù)影響[6-7]。為了改善妊娠結(jié)局，通過(guò)精子優(yōu)選技術(shù)去除冷凍精液的雜質(zhì)、碎片和冷凍保存液，獲得高前向運(yùn)動(dòng)精子活率、高細(xì)胞形態(tài)正常及DNA完整率、少損傷、無(wú)凋亡的精子懸液是AID和IVF-D技術(shù)中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

SW法操作簡(jiǎn)單，處理時(shí)間短，但優(yōu)選效果較差。本實(shí)驗(yàn)中，SW組，冷凍精子優(yōu)選前后精子運(yùn)動(dòng)活力、膜完整性、正常形態(tài)率及DNA完整率均沒(méi)有明顯改善，結(jié)果與以往新鮮精液的研究[7]一致。DGC組通過(guò)離心力的作用使得精液中各種成分在密度梯度溶液柱中達(dá)到平衡，而停留在各自的等浮力密度點(diǎn)上，從而分離出正常的精子。分離得到的精子前向運(yùn)動(dòng)活率、膜完整率、正常形態(tài)率及DNA完整性均得到了改善，結(jié)果與以往新鮮精液的優(yōu)化研究[7-8]一致，但反復(fù)長(zhǎng)時(shí)間離心對(duì)精子可能造成一定的損傷[9]。SU依靠精子的活力進(jìn)行優(yōu)選，優(yōu)點(diǎn)是由于純物理作用分離，對(duì)精子損傷小，能獲得較高前向運(yùn)動(dòng)精子活率、膜完整性、正常形態(tài)率及DNA完整性的精子懸液。本研究中，SU組優(yōu)選后，精子前向運(yùn)動(dòng)活率、膜完整率、正常形態(tài)率及DNA完整性顯著改善，結(jié)果與以往新鮮精液的優(yōu)化研究[7]一致，但耗時(shí)長(zhǎng)，精子回收率低，長(zhǎng)時(shí)間操作易造成精子損傷[9]。MACS的優(yōu)選原理是將膜聯(lián)蛋白V偶聯(lián)在微小的磁珠上，將精子混懸液同磁珠混勻孵育，磷脂酰絲氨酸(PS)外翻(凋亡)的精子就會(huì)吸附在磁珠上[10]，將此混合液通過(guò)具有磁性的MACS分選柱，吸附凋亡精子的磁珠便會(huì)吸附在分選柱上，其他精子則會(huì)自由通過(guò)[11]。MACS可以很好地去除凋亡精子，從而優(yōu)化冷凍精液的正常形態(tài)率、膜完整性和DNA完整率。本研究中，MACS組優(yōu)選后，精子膜完整率、正常形態(tài)率及DNA完整率均顯著高于優(yōu)選前，結(jié)果與以往對(duì)于新鮮精液優(yōu)化的MACS研究結(jié)果[12-13]一致。但MACS不能很好地改善冷凍精液的前向運(yùn)動(dòng)率。

這4種方法在處理冷凍精子方面各有優(yōu)缺點(diǎn)，臨床可以根據(jù)精液標(biāo)本的質(zhì)量或者對(duì)于精液制備液的要求來(lái)選擇不同的精子優(yōu)化方法。SW回收率高，但優(yōu)化效果差，適用于質(zhì)量好但精子濃度較低的冷凍精子優(yōu)化，用于AID的治療。DGC可以很好地改善冷凍精液的質(zhì)量，可以應(yīng)用于AID/IVF-D/ICIS的治療。SU可以很好地改善冷凍精液的前向運(yùn)動(dòng)精子活率、膜完整性和正常形態(tài)率，獲得的精子懸液在前向運(yùn)動(dòng)精子活率以及正常形態(tài)率方面優(yōu)于其他方法，但回收率較低，故可以應(yīng)用于精子濃度較高但質(zhì)量較差的冷凍精子的優(yōu)化或應(yīng)用于IVF-D/ICSI治療。4種方法中，MACS可以很好地優(yōu)選冷凍精液的DNA完整率，但對(duì)改善精液前向運(yùn)動(dòng)活率沒(méi)有顯著成效。越來(lái)越多的研究證明精子核DNA的完整度和精子膜的完整度影響受精后的胚胎發(fā)育潛能或?qū)е屡咛グl(fā)育的異常，從而影響輔助生殖技術(shù)臨床結(jié)局和出生后代的異常[14]，故可以將MACS應(yīng)用于IVF-D/ICSI的治療，保障具有完整DNA的冷凍精子與卵母細(xì)胞受精，從而得到健康后代。目前，已有利用MACS優(yōu)選新鮮精子后行ICSI成功妊娠并分娩健康嬰兒的報(bào)道[15]。

SW、DGC和SU目前已廣泛應(yīng)用于臨床。MACS對(duì)IVF-D/ICSI(尤其是ICSI)的治療有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[16]，可以保證受精后胚胎發(fā)育的潛能及胚胎正常發(fā)育，因此認(rèn)為MACS在輔助生殖領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定前景。但本研究中每個(gè)實(shí)驗(yàn)組只使用了20例冷凍精液標(biāo)本，樣本量少，并且缺乏MACS后精液用于臨床治療的受精率、優(yōu)胚率及妊娠率等數(shù)據(jù)。所以對(duì)于MACS在輔助生殖領(lǐng)域的推廣還需要開(kāi)展更大樣本量及多中心的研究加以探討驗(yàn)證。