杜兆金，吳雅慧，王楠

(1.青島大學(xué)附屬青島婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，青島 266000；2.威海市立醫(yī)院婦產(chǎn)科，威海 264200)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，流行病學(xué)研究表明，隨著飲食習(xí)慣改變和生活水平提高，世界范圍內(nèi)糖尿病發(fā)病率逐年增高，成為威脅人類健康的主要代謝類疾病[1]。患者血糖長期處于較高水平，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，影響細(xì)胞正常生長，繼而出現(xiàn)細(xì)胞病變或凋亡[2-3]。據(jù)報(bào)道，2型糖尿病可導(dǎo)致患者性腺功能下降，精子存活率低[4]，但其作用機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路與高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，是多種并發(fā)癥發(fā)生過程中的重要因素[5]，然而Notch信號通路在小鼠精母細(xì)胞凋亡中的作用尚不清楚。本研究通過觀察高糖對小鼠精母細(xì)胞GC-2spd細(xì)胞生長、凋亡及Notch信號通路的影響，探究高糖誘導(dǎo)小鼠精母細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為尋找改善糖尿病患者精子存活情況的治療方案提供思路。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及試劑

1.細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠精母細(xì)胞GC-2spd(貨號：CRL-2196TM)購自上海酶聯(lián)生物研究所。小鼠精母細(xì)胞復(fù)蘇后轉(zhuǎn)入M16培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，加入鏈霉素和青霉素，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(5%CO2，37℃)，收集生長至對數(shù)期細(xì)胞。

2.主要試劑與儀器：M16培養(yǎng)液、胎牛血清、葡萄糖購自美國Sigma公司；胰蛋白酶、蛋白提取試劑盒(P0033)、CKK-8試劑盒(C0037)、細(xì)胞周期檢測試劑盒(C1052)、AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1063)，均購自上海碧云天公司；AceQ qPCR SYBR Green Mix(Q121-02)購自南京vazyme生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037Q)、Trizol試劑購自日本Takara公司；兔源Notch1抗體、Jagged1抗體、Hes1抗體、cleaved-caspase3抗體、GAPDH抗體、cleaved-caspase9抗體、羊抗兔二抗，均購自美國Abcam公司；自動酶標(biāo)儀(Elx800)、熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀(CytoFLEX)購自德國MICROM公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：收集對數(shù)期小鼠精母細(xì)胞GC-2spd，加入胰蛋白酶(0.25%)對GC-2spd細(xì)胞進(jìn)行消化，轉(zhuǎn)接于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1×105個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長至融合度約80%時(shí)，分別更換培養(yǎng)基，對細(xì)胞進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)分為兩組：(1)對照組：培養(yǎng)液中加入終濃度為5 mmol/L葡萄糖；(2)高糖組：培養(yǎng)液中加入終濃度為30 mmol/L葡萄糖。在高糖誘導(dǎo)48 h后，收集各組GC-2spd細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

2.CKK-8法檢測GC-2spd細(xì)胞生長情況：收集上述兩組GC-2spd細(xì)胞，轉(zhuǎn)接至96孔板(5 000個(gè)/孔)，加入相應(yīng)濃度葡萄糖的M16培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h后加入CKK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用全自動酶標(biāo)儀(Elx800)檢測各孔細(xì)胞在450 nm波長下光密度值(OD)。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測GC-2spd細(xì)胞周期和凋亡：收集兩組GC-2spd細(xì)胞，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒和AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說明書處理樣品，采用流式細(xì)胞儀檢測，借助CellQuest軟件獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用ModFit LT4.0軟件分析數(shù)據(jù)。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測caspase3、caspase9、Notch1、Jagged1、Hes1基因表達(dá)：收集兩組GC-2spd細(xì)胞，采用Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按照AceQ qPCR SYBR Green Mix試劑盒說明書對caspase3、caspase9、Notch1、Jagged1和Hes1基因進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔCT對各目標(biāo)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。qRT-PCR引物由上海生工生物公司合成，具體序列見表1。

表1 Notch1、Jagged1、Hes1、caspase3、caspase9和GAPDH的qRT-PCR引物序列

5. 蛋白印跡(WB)法檢測cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達(dá)：收集兩組GC-2spd細(xì)胞，加入1.2 ml蛋白裂解液，逐步提取GC-2spd細(xì)胞中總蛋白，采用試劑盒測定蛋白總量。經(jīng)SDS-凝膠電泳分離后，采用半干轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上；采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；之后分別加入兔源一抗Notch1抗體、Jagged1抗體、Hes1抗體、cleaved-caspase3抗體、GAPDH抗體和cleaved-caspase9抗體(1∶500)4℃孵育過夜；采用1倍磷酸緩沖液沖洗后，分別加入羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法檢測PVDF膜上的目標(biāo)蛋白信號，Tanon軟件拍攝圖像并分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、高糖對GC-2spd細(xì)胞生長的影響

與對照組比較，高糖組存活小鼠精母細(xì)胞GC-2spd數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，見圖1。

二、高糖對GC-2spd細(xì)胞周期的影響

與對照組比較，高糖組G0/G1期小鼠精母細(xì)胞GC-2spd比例顯著增高，G2/M期GC-2spd細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)；而S期小鼠精母細(xì)胞GC-2spd比例兩組間無顯著性差異(P>0.05)，見圖2。

圖1 高糖對GC-2spd細(xì)胞生長的影響

三、高糖對GC-2spd細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，高糖組小鼠精母細(xì)胞GC-2spd的早期凋亡率、晚期凋亡率均顯著增高(P<0.05)，見圖3。

A：對照組GC-2spd細(xì)胞周期情況；B：高糖組GC-2spd細(xì)胞周期情況；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測GC-2spd細(xì)胞周期變化：與對照組比較，*P<0.05圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測高糖對GC-2spd細(xì)胞周期的影響

A：對照組GC-2spd細(xì)胞凋亡情況；B：高糖組GC-2spd細(xì)胞凋亡情況；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測GC-2spd細(xì)胞凋亡的變化：與對照組比較，*P<0.05圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測GC-2spd細(xì)胞凋亡情況

四、高糖對GC-2spd細(xì)胞中caspase凋亡蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，高糖組小鼠精母細(xì)胞GC-2spd中caspase3和caspase9 mRNA及活性蛋白相對表達(dá)量均顯著增高(P<0.05)，見圖4。

五、高糖對GC-2spd細(xì)胞Notch通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對照組比較，高糖組小鼠精母細(xì)胞GC-2spd中Notch、Jagged1、Hes1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖5。

A：qRT-PCR檢測GC-2spd細(xì)胞中caspase mRNA相對表達(dá)量；B：WB法檢測GC-2spd細(xì)胞中caspase凋亡蛋白表達(dá)情況。與對照組比較，*P<0.05圖4 高糖對GC-2spd細(xì)胞中caspase凋亡蛋白表達(dá)的影響

A：qRT-PCR檢測GC-2spd細(xì)胞中Notch通路mRNA相對表達(dá)量；B：WB法檢測GC-2spd細(xì)胞中Notch通路蛋白表達(dá)情況。與對照組比較，*P<0.05圖5 高糖對GC-2spd細(xì)胞中Notch通路蛋白表達(dá)的影響

討 論

精子發(fā)生過程起始于精原細(xì)胞，先經(jīng)過有絲分裂增殖分化為初級精母細(xì)胞，后經(jīng)過減數(shù)分裂最終分化為成熟精子[6]。初級精母細(xì)胞的凋亡對淘汰缺陷精子、維持成熟精子數(shù)量非常重要，其異常凋亡會導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，影響生育能力，因此精母細(xì)胞存活情況和健康程度是決定精子質(zhì)量的關(guān)鍵[7-8]。本研究采用終濃度為30 mmol/L葡萄糖的M16培養(yǎng)液模擬體內(nèi)高糖環(huán)境，觀察高糖對小鼠精母細(xì)胞GC-2spd增殖和細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖作用24 h后，同一時(shí)間點(diǎn)高糖組小鼠精母細(xì)胞GC-2spd的OD值均顯著降低(P<0.05)，表明高糖作用后小鼠精母細(xì)胞GC-2spd生長速度顯著減慢，提示高糖可抑制GC-2spd細(xì)胞生長。且高糖組G0/G1期GC-2spd細(xì)胞比例顯著增高，G2/M期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，提示高糖可誘導(dǎo)GC-2spd細(xì)胞停滯在G0/G1期，阻止其進(jìn)入G2/M期，抑制細(xì)胞增殖。表明高糖可阻滯細(xì)胞周期，使其失去分裂能力，影響細(xì)胞生長，但其具體機(jī)制尚不清楚。另有研究表明G0/G1期細(xì)胞增多與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[9-10]，因此本研究進(jìn)一步對高糖對GC-2spd細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行研究。

精子存活率低與精母細(xì)胞異常凋亡密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖作用后，GC-2spd細(xì)胞早、晚期凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)，表明高糖環(huán)境可促進(jìn)GC-2spd細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是機(jī)體自主調(diào)控的一種死亡過程，涉及一系列凋亡誘導(dǎo)因子和凋亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)[11]。其中依賴caspase凋亡通路是主要的凋亡通路，一般情況下，細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者caspase3以前體的形式存在[12]；當(dāng)細(xì)胞接觸到凋亡信號或刺激后，經(jīng)過一系列的信號傳導(dǎo)，引起caspase9大量表達(dá)，誘導(dǎo)Procaspase3裂解活化，啟動細(xì)胞凋亡程序[13]。本研究中，高糖作用48 h后，caspase3、caspase9在小鼠精母細(xì)胞GC-2spd中mRNA及活性蛋白相對表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)，提示高糖處理可誘導(dǎo)小鼠精母細(xì)胞caspase3凋亡通路活化，啟動凋亡，但其機(jī)制尚不明確。

Notch信號通路的激活依賴于Notch基因編碼的跨膜受體與其鄰近細(xì)胞表面的配體相互結(jié)合，進(jìn)而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理生化過程[14]。目前已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)4種Notch基因編碼的跨膜受體，分別為Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4以及dll1、dll3、dll4、Jagged1、Jagged2五種配體[15]。Yoon等[16]采用體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M高糖對血管生成過程的影響，發(fā)現(xiàn)高糖條件下，血管出現(xiàn)直徑減小、生長和分支增加、不穩(wěn)定性增加等，認(rèn)為高糖可能抑制Notch1和Jagged1蛋白表達(dá)，導(dǎo)致異常血管生成。Zhang等[17]采用高糖處理H9c2細(xì)胞建立糖尿病心肌損傷模型，發(fā)現(xiàn)高糖可抑制Notch1蛋白在H9c2細(xì)胞中表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且Notch1過表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。Allam等[18]研究發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌細(xì)胞中糖基化可通過促進(jìn)Notch受體的活化狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，抑制Notch蛋白活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示抑制糖基化水平可通過抑制Notch活化抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。Wei等[19]研究報(bào)道，Notch1、Hes1等蛋白在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中低表達(dá)，松弛素可通過調(diào)節(jié)Notch通路抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，增加其生存能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖組GC-2spd細(xì)胞中Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，表明高糖可抑制Notch信號通路活化，與Zhang等[17]在H9c2細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)一致。另有研究表明，Notch通路相關(guān)基因的異常激活可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，與糖尿病所致心肌梗死等多種疾病的發(fā)生相關(guān)[20]，提示抑制Notch通路激活可能抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但高糖如何抑制Notch信號通路活化及該通路如何影響細(xì)胞增殖和凋亡的具體機(jī)制尚未闡明，有待進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，高糖可能通過抑制Notch信號通路活化抑制GC-2spd細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，提示Notch信號通路可能作為潛在靶標(biāo)應(yīng)用于糖尿病所致精子存活率低的臨床治療。