硫化氫對大鼠肢體再灌注損傷后炎癥因子和線粒體能量代謝障礙的影響

2019-06-19 02:56:02楊永華楊海龍王溪淳

中國醫(yī)學科學院學報 2019年2期

楊永華，王偉，胡斌，楊海龍，王溪淳

1九江市第一人民醫(yī)院骨科，江西九江 3320002湘雅醫(yī)學院附屬第二人民醫(yī)院骨科，長沙 410008

骨骼肌缺血再灌注損傷是肢體手術治療過程中十分常見的病理變化[1- 3]。在下肢斷肢再植手術、下肢動脈栓塞手術、主動脈瘤手術以及動脈粥樣硬化手術等眾多下肢外科操作中不可避免地導致了肢體的缺血再灌注損傷。盡管肢體缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚未完全弄清，但研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注過程所誘發(fā)白介素和腫瘤壞死因子等多種炎癥因子的急劇釋放而形成局部炎性的“瀑布效應”、骨骼肌細胞線粒體能量代謝障礙以及隨后發(fā)生的細胞壞死及凋亡均有著密切關聯(lián)[4- 5]。已有研究顯示硫化氫能夠特異性地清除體內(nèi)亞硝酸根和羥自由基發(fā)揮其拮抗氧化應激作用，且硫化氫可顯著減輕心肌、腦組織以及腸等器官的缺血再灌注損傷[6- 7]。現(xiàn)階段研究顯示，外源性H2S補充可以通過降低炎性細胞浸潤及炎性細胞因子激活、直接清除氧自由基、增加內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)的活力、降低醛固酮水平而對骨骼肌缺血再灌注后心肌損傷發(fā)揮保護作用。本研究的創(chuàng)新之處在于提取骨骼肌細胞線粒體進行線粒體跨膜電位測定及ATP含量檢測，以探討硫化氫對大鼠肢體缺血再灌注導致的骨骼肌損傷的保護作用機制。

材料和方法

實驗動物采用購于湘雅醫(yī)學院實驗動物中心的健康、成年雄性Wistar大鼠60只，均為雌性(批號：2018- 0256)，鼠齡相同，體重220～260 g，符合國家二級實驗動物標準，常規(guī)條件下進行標準飼養(yǎng)。

主要器材和試劑動物手術器械包購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；上海精科原子吸收分光光度計361CRT；自動生化分析儀ADVIA 2400購自上海；SuPerMax- 3100Plus型多功能酶標儀系統(tǒng)購自上海閃譜生物科技有限公司；美國伯樂Basic基礎電泳儀購自北京嘉鵬同創(chuàng)科技發(fā)展有限公司；Hettich離心機購自北京速達設備維修有限公司；電熱恒溫箱購自上海智城分析儀器制造有限公司；美國Scientific Industries振蕩器購自奧然科技有限公司；奧林巴斯BX53熒光顯微鏡購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司。硫氫化鈉(NaHS)水合 Sigma購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；水合氯醛溶液(10% w/v)購自上海羽朵生物科技有限公司；青霉素G鈉鹽購自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司；云南白藥粉購自云南白藥集團股份有限公司；3%雙氧水購自上海生物工程有限公司；10%中性福爾馬林液購自上海羽朵生物科技有限公司。

下肢缺血再灌注損傷動物模型制作實驗Wistar大鼠自由飲水及攝食，環(huán)境溫度(25.0±2.0)℃，濕度(60±5)%，12 h光照周期。在手術操作前均禁食12 h，不限飲水。5%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，肌注阿托品0.04 mg，待大鼠翻正反射及角膜反射消失，將大鼠右后肢毛發(fā)剪除，將大鼠仰臥位固定于動物實驗手術臺，2%碘伏消毒右后肢局部皮膚，鋪無菌巾單后，切開右后肢處皮膚，顯露右側股動脈，采取Bulldog無創(chuàng)血管阻斷技術游離右側股動脈并用血管夾鉗夾，將股動脈游離一段約1 cm，在股動脈的遠端監(jiān)測血壓，當血液計讀數(shù)為零時表明大鼠肢體缺血模型制作成功，連續(xù)保持缺血4 h后，打開動脈夾，恢復右側股動脈血流，監(jiān)測到血壓上升，標志右后肢再灌注成功，術畢，縫合右后肢皮膚。待后續(xù)實驗。

實驗分組選擇60只Wistar大鼠。A組為假手術組(Sham組)20只，B組為對照組(缺血-再灌注損傷+生理鹽水組)20只、C組為實驗組(缺血-再灌注損傷+H2S 組)20只。A組大鼠麻醉完成后僅行手術暴露并游離右側股動脈，不進行動脈夾閉處理，暴露4 h后經(jīng)鼠尾靜脈緩慢注射1 ml生理鹽水；B組大鼠麻醉完成后切開暴露游離右側股動脈，鉗夾4 h后打開行后肢缺血再灌注處理，同時經(jīng)鼠尾靜脈注射1 ml生理鹽水；C組大鼠麻醉完成后切開暴露游離右側股動脈，鉗夾4 h后打開行后肢缺血再灌注處理，同時經(jīng)鼠尾靜脈注射含5 μmol/L NaHS的溶液1 ml。3組Wistar大鼠均于再灌注成功后0、3、6、9、12、15 h經(jīng)左下肢靜脈分別采血；于再灌注成功15 h后切開頸動脈放血處死大鼠，并切取Wistar大鼠右后肢的肌肉組織，將骨骼肌組織用冷生理鹽水反復沖洗去除殘留血液，用于分析測定與線粒體的提取。此外，同時取大鼠肝臟、肺臟和腎臟組織，其處理方法與骨骼肌同。

肢體骨骼肌、肝臟、肺臟和腎臟組織內(nèi)壞死分解產(chǎn)物測定應用自動化分析儀測定大鼠肢體骨骼肌、肝臟、肺臟和腎臟組織內(nèi)肌紅蛋白(myoglobin，MB)、脂蛋白復合物(lipoprotein complex，LPC)以及脂質過氧化物(lipid peroxide，LPO)的含量。

血清中炎癥因子含量的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠于缺血再灌注后0、3、6、9、12、15 h各時間點血清中白介素(interleukin，IL)- 1、IL- 6及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性因子的含量。

骨骼肌細胞內(nèi)線粒體能量代謝測定部分大鼠肢體骨骼肌組織標本經(jīng)0.9%冷生理鹽水洗凈后用于制備骨骼肌細胞懸液，再應用熒光探針技術，提供通過JC- 1熒光染色對骨骼肌細胞的線粒體進行熒光染色標記，然后用流式細胞儀進行測定。通過比較熒光染色為紅色的線粒體與熒光染色為綠色的線粒體兩者之間的熒光強度，反映大鼠肢體骨骼肌細胞內(nèi)線粒體的跨膜電位情況。并利用ATP 檢測試劑盒繪制肌肉組織細胞線粒體ATP 含量標準曲線，計算線粒體ATP的含量。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件(美國IBM公司)進行處理；計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用百分率(%)表示，組間比較采用χ2分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

硫化氫對缺血再灌注所致骨骼肌破壞程度對照組大鼠在缺血再灌注損傷后肢體骨骼肌、肝臟、肺臟及腎臟組織內(nèi)MB、LPO和LPC的含量均明顯增高(MB：P骨骼肌=0.003，P肝臟=0.001，P肺臟=0.001，P腎臟=0.001；LPO：P骨骼肌=0.001，P肝臟=0.001，P肺臟=0.001，P腎臟=0.002；LPC：P骨骼肌=0.000，P肝臟=0.002，P肺臟=0.002，P腎臟=0.003)，而缺血再灌注時采用硫化氫處理可明顯抑制MB、LPO及LPC的生成(MB：P骨骼肌=0.021，P肝臟=0.036，P肺臟=0.005；LPO：P骨骼肌=0.003，P肝臟=0.008，P肺臟=0.010，P腎臟=0.015；LPC：P骨骼肌=0.002，P肝臟=0.026，P肺臟=0.007，P腎臟=0.006)(表1～3)。

硫化氫對缺血再灌注大鼠血清炎性反應的影響大鼠下肢缺血再灌注可導致大鼠血清中IL- 1、IL- 6及TNF-α的含量均升高，并且隨著時間推移，IL- 1、IL- 6及TNF-α含量升高呈遞增趨勢，且自3 h時各組間IL- 1、IL- 6及TNF-α含量差異有統(tǒng)計學意義(IL- 1：P3 h=0.019，P6 h=0.011，P9 h=0.009，P12 h=0.008，P15 h=0.002；IL- 6：P3 h=0.026，P6 h=0.009，P9 h=0.002，P12 h=0.002，P15 h=0.003；TNF-α：P3 h=0.002，P6 h=0.002，P9 h=0.005，P12 h=0.002，P15 h=0.003)。而缺血再灌注時采用硫化氫處理可明顯抑制血清中 IL- 1、IL- 6及TNF-α的含量水平(IL-1：P3 h=0.035，P6 h=0.039，P9 h=0.012，P12h=0.005，P15 h=0.006；IL- 6：P3 h=0.042，P6 h=0.025，P9 h=0.023，P12h=0.006，P15 h=0.005；TNF-α：P3 h=0.005，P6 h=0.003，P9 h=0.022，P12h=0.005，P15 h=0.005)，隨著時間推移，其抑制效果越明顯(表4～6)。

表1 硫化氫對大鼠骨骼肌、肝臟、肺臟及腎臟中肌紅蛋白水平的影響(n=20，-±s，nmol/mg)Table 1 Effects of hydrogen sulfide on myoglobin level in skeletal muscle，liver，lung，and kidney of rats(n=20，-±s，nmol/mg)

P1：假手術組與對照組比較；P2：實驗組與對照組比較