段娟娟，張啟芳，黃宗華，曾紅梅，柏 華，5，6

1貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州都勻 5580002貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴陽 5500043貴州醫(yī)科大學(xué)教育部地方和少數(shù)民族疾病重點實驗室，貴陽 5500044貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科，貴州都勻 5580005貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴陽 5500046貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，貴州都勻 558000

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種老年人常見的癡呆類疾病，β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)與AD的發(fā)病關(guān)系密切[1]；Aβ有可能通過激活小膠質(zhì)細胞中的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding domain and leucine-rich-repeat-containing family and pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎性小體，導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)性炎癥反應(yīng)從而促進AD的發(fā)生和發(fā)展[2]。 BV2 細胞具備原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)、表型以及各項功能特點，它是應(yīng)用攜帶癌基因 v-myc 的反轉(zhuǎn)錄病毒J2 感染原代培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細胞而獲得的永生細胞，用活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)劑過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo) BV2細胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷模型能夠比較簡潔和直觀地用于研究AD等神經(jīng)變性疾病[3]。組織蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)是一種存在于細胞溶酶體內(nèi)的蛋白水解酶，它能催化苯甲酰-L-精氨酰胺的水解，細胞內(nèi)外多種刺激因素可以引起溶酶體膜的通透性變化，導(dǎo)致CTSB從溶酶體釋放進入胞漿，參與激活細胞凋亡通路[4]。有研究顯示，CTSB活性與AD患者血液中的白細胞介素- 1β(interleukin- 1β，IL- 1β)和丙二醛水平呈正相關(guān)，但與AD患者血液中谷胱甘肽水平呈負相關(guān)，提示氧化應(yīng)激通過上調(diào)CTSB的活性激活NLRP3[5]。在實驗性大鼠心肌梗死模型中，CTSB的抑制劑環(huán)氧酶琥珀肽甲基酯[L- 3-trans-(propyl-carbamoyloxirane- 2-carbonyl)-L-isoleucyl-L-proline methyl ester，CA- 074Me]通過NLRP3信號通路能夠促進心肌重塑[6]。溶酶體破裂釋放的內(nèi)容物具有激活NLRP3炎癥小體的作用，其中有可能主要是CTSB在起作用；CTSB可能是通過降解NLRP3的抑制蛋白再激活NLRP3炎癥小體。另外，分布于溶酶體中的溶酶體離子通道蛋白-瞬時受體電位黏蛋白- 1(transient receptor potential mucolipin- 1，TRPML1)對細胞膜轉(zhuǎn)運、細胞自噬、胞吞作用及維持離子平衡具有重要的作用。TRPML1受pH值和鈣離子調(diào)節(jié)，并對鈣離子具有通透性[7]。推測在某些AD的發(fā)病過程中可能有CTSB的參與，CTSB是NLRP3炎癥小體活化的一種上游信號，這種活化需要TRPML1基因表達的增加和鈣離子信號的介導(dǎo)。本研究擬探討在細胞氧化應(yīng)激模型和特異性沉默TRPML1基因后的BV2細胞模型中，CTSB對NLRP3炎癥小體活化的影響以及TRPML1基因表達是否影響CTSB的變化。

材料和方法

細胞培養(yǎng)與分組小鼠BV2細胞(購自上海素爾生物科技有限公司)貼壁生長在含12%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(加低濃度的青霉素和鏈霉素)，置入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4～6天傳代1次，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。實驗分4組。第1組為PBS處理組，作為對照組，用PBS 5 ml孵育細胞20 min，隨后提取細胞的RNA或總蛋白，或者按實驗要求繼續(xù)培養(yǎng)；第2組為H2O2處理組，單純用0.5 mmol/L H2O2孵育細胞20 min，然后提取細胞的RNA或總蛋白。第3組為H2O2+GdCl3組，先用0.5 mmol/L的H2O2處理細胞20min，再換成2 mmol/L的GdCl3處理細胞15 min，最后進行細胞RNA或總蛋白的提??；第4組為H2O2+GdCl3+CA- 074Me組，先用5 μmol/L的CA-074Me預(yù)處理細胞10 min，接著加入0.5 mmol/L的H2O2共同處理細胞20 min，再換成2 mmol/L的GdCl3處理細胞15 min，最后進行細胞RNA或總蛋白的提取。如果分析細胞生長狀況，則在上述處理結(jié)束后繼續(xù)換成1640培養(yǎng)基按需要的程序培養(yǎng)。各處理組均需要加用100 ng/ml濃度的脂多糖(Sigma，Cat#：L6529)進行預(yù)處理2 h。

酶聯(lián)免疫分析法檢測細胞中的半胱天冬酶-1和IL- 1β蛋白檢測均采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法，酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購于上海嵐派生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。使用BIO-RAD- 680型酶標(biāo)儀，630/450 nm雙波長測定光密度(optical density，OD)值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線并計算樣品濃度。每組檢測重復(fù)5次，取平均值。

MTT比色法檢測細胞生長活力將BV2細胞接種于96孔板，經(jīng)各組試劑處理后，在培養(yǎng)基中加入1 g/L的噻唑藍，37 ℃溫育4 h，吸除培養(yǎng)基，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩10 min。實驗操作時設(shè)置調(diào)零孔、對照孔和加藥孔；調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、DMSO；對照孔和加藥孔都要加細胞、培養(yǎng)液、MTT、DMSO。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測每孔光密度，間接反應(yīng)活細胞的數(shù)量，并作細胞生長曲線分析。以時間為橫坐標(biāo)、以紫外分光光度計所測得的OD值為縱坐標(biāo)做生長曲線，每個時間點計數(shù)細胞7次。

質(zhì)粒構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染從NCBI 基因庫中獲得小鼠TRPML1基因的全序列，注意下游附近的20余個核苷酸，去除與其他基因有高度同源性的序列，探測目標(biāo)序列為：5’-CCCACATCCAGGAGTGTAA- 3’ 。使用英杰生命技術(shù)公司(Invitrogen)專有的BLOCK-iT RNAi方案設(shè)計并合成兩對干擾片段短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)1、shRNA2 和一對無關(guān)序列片段，由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司提供帶有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性篩選標(biāo)記的TRPML1基因沉默重組慢病毒顆粒慢病毒介導(dǎo)的帶有TRPML1的shRNA(LV-shRNA-TRPML1)及對照空載體慢病毒介導(dǎo)的帶有空載體的shRNA(LV-shRNA-NC)。取對數(shù)生長期的BV2細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/ml，接種于6孔板中，1 ml/孔。按照LipofectamineTM- 2000說明書轉(zhuǎn)染BV2細胞。轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)基加G418進行抗性篩選；挑出單克隆，擴大培養(yǎng)，獲得的轉(zhuǎn)染細胞命名為Tr-si-BV2細胞，轉(zhuǎn)染空載體所獲得的細胞命名為si-Scr-BV2 細胞。BV2細胞(或si-Scr-BV2 細胞)和Tr-si-BV2細胞同時傳代生長4～6 d后，提取總蛋白，再做蛋白免疫印跡檢測分析鑒別相關(guān)蛋白表達量。用TRPML1 siRNA或Scramble(Scr)RNA轉(zhuǎn)染BV2細胞60 h，再用0.3 mmol/L 的H2O2處理細胞3 h，用Western blot 檢測CTSB表達。

Western blot檢測NLRP3蛋白各組細胞達到處理時間后，將培養(yǎng)液吸棄，用預(yù)冷的PBS清洗1次，加入200 μl放射免疫沉淀實驗細胞裂解液和苯甲基磺酰氟，放在冰面上裂解20 min，以12 000×g、4°C 離心10 min，吸取上清，BAC法進行蛋白定量檢測。取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，先在80V電泳30 min，然后在120V電泳90 min，然后在250mA下電轉(zhuǎn)膜80 min。用含有脫脂奶粉的、混有聚山梨醇酯20的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(10 mmol/L Tris-HCI+0.15 mol/LNaCl+0.1% Tween- 20)封閉60 min。加入適當(dāng)稀釋的一抗：1∶500的兔抗鼠CTSB抗體、1∶400的兔抗鼠TRPML1抗體、1∶500的兔抗鼠轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)抗體、1∶1000的兔抗鼠微管蛋白抗體、1∶1000的兔抗鼠甘油醛- 3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白抗體、1∶400的兔抗鼠組織蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)抗體、1∶500的兔抗鼠組織蛋白酶L(cathepsin L，CTSL)抗體、1∶500的兔抗鼠組織蛋白酶V(cathepsin V，CTSV)抗體，以檢測上述相應(yīng)的蛋白。4°C過夜，再加入相應(yīng)的生物素化二抗，室溫放置120 min；然后加入ABC復(fù)合物、室溫放置30 min，再加入DAB顯色液。以微管蛋白(tubulin)作為內(nèi)對照，相同條件下重復(fù)3次。Western blot 檢測結(jié)果的條帶灰度用BIO-RAD公司的Quantity-One 分析軟件。

實時定量PCR檢測mRNA分別收集上述各處理組細胞低溫保存?zhèn)溆?。采用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒進行標(biāo)本RNA的抽提，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)DNAMAN軟件進行引物序列設(shè)計。NLRP3上游引物：5’-CCACAAGATCGYGAGAAAACCC- 3’，下游引物：5’-CGGTCCTATGTGCTCGTCA- 3’；TRPML1上游引物：5’-TCTTCCAGCACGGAGACAAC- 3’，下游引物：5’-AACTCGTTCTGC-AGCAGGAAGC- 3’。胱抑素C(cystatin C，Cys C)上游引物：5’-GATCGTAGCTG GGGTGAACT- 3’，下游引物：5’-CCTTTTCAGATGTGGCTGGT- 3’。β-actin上游引物：5’-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA- 3’，下游引物：5’-GTCGGAGATT-CGTAGCTGGA- 3’。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃，15 s變性、60 ℃ 1 min退火、60 ℃ 1 min延伸，40個循環(huán)。根據(jù)約定公式計算mRNA的相對表達量。以β-actin為內(nèi)參照。

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS l6.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，各組實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準差表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組內(nèi)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

NLRP3 mRNA的表達在BV2細胞各處理組中定量PCR結(jié)果顯示，PBS組、H2O2組、H2O2+GdCl3組、H2O2+GdCl3+CA- 074Me組的NLRP3 mRNA 相對含量分別為：3.24±0.45、5.45±0.78、5.96±0.81、3.19±0.38；PBS組與H2O2組或H2O2+GdCl3組比較，NLRP3 mRNA 相對含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.14，P=0.0012；t=8.79，P=0.0009)；H2O2組與H2O2+GdCl3+CA- 074Me組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t= 0.85，P=0.32)；H2O2+GdCl3組與H2O2+GdCl3+CA- 074Me組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t= 5.18，P=0.037)。其余各組兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

半胱天冬酶- 1和IL- 1β蛋白的變化情況ELISA檢測顯示，單純使用H2O2組或H2O2+GdCl3處理組與PBS組(僅用PBS處理)比較，半胱天冬酶-1明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.24，P=0.031)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me組與 H2O2+GdCl3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.68，P=0.021)。H2O2+GdCl3組與PBS組比較，BV2細胞中IL- 1β蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.70，P=0.0036)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me組與 H2O2+GdCl3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.08，P=0.036)；單純H2O2處理組與PBS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.48，P>0.05)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me組與PBS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.79，P>0.05)(表1)。

表1 BV2細胞中不同處理組半胱天冬酶- 1和白細胞介素- 1β的比較(-±s)Table 1 Levels of caspase- 1 and interleukin- 1β in BV2 cell from four groups(-±s)

與PBS組比較，aP<0.05，bP<0.01；與H2O2+GdCl3組比較，cP<0.05

aP<0.05，bP<0.01 compared with PBS group；cP<0.05 compared with H2O2+GdCl3group

細胞生長活力選擇BV2細胞的4組處理細胞分析細胞生長活力，各組細胞在進行相應(yīng)處理后，再轉(zhuǎn)換成1640培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，每天觀察細胞生長和細胞活力，用MTT法間接進行細胞計數(shù)，各組細胞每個時間點檢測12次(有4個復(fù)孔并重復(fù)3次)，取平均值，并作圖比較，結(jié)果顯示H2O2+GdCl3組生長最慢，H2O2組生長較慢，H2O2+GdCl3+CA- 074Me組的細胞生長相對較快(圖1)。組間方差分析顯示H2O2+GdCl3組與PBS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.13，P=0.0065)，H2O2組與PBS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.27，P=0.026)；H2O2+GdCl3+CA- 074Me組與PBS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.45，P>0.05)。

ROS影響溶酶體鈣離子通道蛋白TRPML1和組織蛋白酶B的表達用不同濃度的H2O2處理BV2細胞6 h，分別用定量PCR方法檢測TRPML1和Cys C的mRNA，用 Western blot方法檢測TRPML1、CTSB、CTSD、CTSL、CTSV蛋白的表達，結(jié)果顯示CTSB與TRPML1蛋白均有相似或同步的變化；200 μmol/L處理組與對照組比較，TRPML1 mRNA表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.54，P=0.006)；TRPML1蛋白表達相互之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.69，P=0.0055)。 200 μmol/L處理組與對照組比較，CTSB蛋白表達相互之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.34，P=0.004)。而50 μmol/L處理組或100 μmol/L處理組與對照組比較，同一蛋白或mRNA(CTSB或TRPML1)之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。用定量PCR方法檢測Cys C mRNA 表達水平，結(jié)果顯示各處理組與對照組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。CTSD、CTSL、CTSV各處理組與PBS組或同一蛋白酶各組之間蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

圖1MTT法檢測BV2細胞不同處理組的細胞生長曲線

Fig1The cell growth curve of BV2 cells in different treatment groups(MTT method)

沉默TRPML1基因表達后對H2O2誘導(dǎo)的CTSB表達的影響采用Western blot 檢測已經(jīng)轉(zhuǎn)染和進行了TRPML1基因沉默處理的BV2細胞(Tr-si-BV2)中TRPML1基因的表達，結(jié)果顯示siRNA干擾組的TRPML1的蛋白質(zhì)表達水平顯著低于對照組(siScr組)；TRPML1蛋白表達與內(nèi)參GAPDH蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.04，P=0.0043)(圖3A)。針對Tr-si-BV2細胞進行了CTSB蛋白表達的檢測，Western blot分析顯示H2O2處理組或H2O2+siScr處理組分別與PBS組比較，CTSB蛋白的表達均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.85，P=0.0018；t=7.65，P=0.002)。H2O2+siRNA處理組與H2O2處理組比較，CTSB蛋白的表達顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.40，P=0.021)(圖3B)。轉(zhuǎn)錄因子EB蛋白的表達顯示，H2O2組(t=7.12，P=0.0001)、H2O2+TRPML1 siScr 組(t=6.95，P=0.0043)、H2O2+TRPML1 siRNA 組(t=3.17，P=0.026)與PBS組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

NLRP3炎癥小體的激活與許多慢性炎癥和免疫異常相關(guān)疾病的發(fā)生相關(guān)。NLRP3是人類固有免疫中的重要模式識別受體，NLRP3與下游的接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點蛋白和效應(yīng)蛋白半胱天冬酶一起組裝形成NLRP3炎癥小體，這一炎癥小體對內(nèi)源危險信號和外源微生物有應(yīng)激感受作用[8]。通常認為 NLRP3炎癥小體激活的始動因素有各種病理晶體和相關(guān)病毒，參與NLRP3炎癥小體激活的機制涉及到線粒體損傷、活性氧激活、鉀離子外流、溶酶體破裂、鈣信號傳輸?shù)榷喾N因素[9]。β淀粉樣蛋白通過激活小膠質(zhì)細胞的NLRP3炎癥小體，能夠?qū)е麓竽X內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元變性和死亡，從而誘發(fā)AD[10]；CTSB通過與NLRP3上的亮氨酸富含重復(fù)區(qū)域結(jié)合以降解NLRP3的抑制蛋白，從而促進NLRP3與凋亡相關(guān)斑點蛋白和半胱天冬酶- 1的結(jié)合，并參與激活細胞凋亡相關(guān)通路[11]。本研究以CTSB作為切入點探索NLRP3炎癥小體激活的新路徑，并進一步追蹤介導(dǎo)CTSB作用的信號蛋白。

小膠質(zhì)細胞在AD的發(fā)病過程中既有可能被激活聚集到老年斑周圍，試圖吞噬Aβ 以抑制AD進展；也有可能分泌一些炎癥性細胞因子，促進免疫性神經(jīng)炎癥反應(yīng)和AD發(fā)病[12]。BV2細胞屬于一種永生化的小膠質(zhì)細胞，本研究處理分組首先考慮到需要用過氧化氫誘導(dǎo)BV2細胞氧化應(yīng)激模型，接著考慮用鈣敏感性受體激動劑GdCl3是否能夠強化這種氧化應(yīng)激反應(yīng)，然后再加用CTSB抑制劑CA- 074Me觀察是否能夠部分阻滯上述氧化應(yīng)激反應(yīng)；實驗的預(yù)處理使用脂多糖，是考慮到脂多糖能夠誘導(dǎo)NLRP3蛋白或IL- 1β前體蛋白的表達增加，對活化NLRP3炎癥小體有重要的輔助作用；實驗完成后發(fā)現(xiàn)與預(yù)期的效果比較一致。關(guān)于NLRP3 mRNA的表達，本研究使用實時定量PCR方法進行檢測，結(jié)果顯示在BV2細胞中H2O2組或H2O2+GdCl3組均比PBS組明顯增加，與國際同行的類似實驗結(jié)果[4]基本一致。由于NLRP3炎癥小體的活化不單純是NLRP3的高表達，還涉及一些下游信號分子的活化或高表達[13]，本研究用ELISA方法檢測了BV2細胞中 半胱天冬酶- 1和IL- 1β蛋白的變化情況，結(jié)果顯示在BV2細胞中的H2O2組或H2O2+GdCl3組半胱天冬酶- 1蛋白的表達均比對照組明顯增加；而在BV2細胞中的H2O2+GdCl3組的IL- 1β蛋白表達比對照組明顯增加，H2O2組的IL- 1β蛋白表達比對照組無增加，提示在不同的BV2細胞中部分下游分子活化的時間可能有所滯后。

TRPML1：瞬時受體電位黏蛋白- 1；CTSB：組織蛋白酶B；CTSD：組織蛋白酶D；CTSL：組織蛋白酶L；CTSV：組織蛋白酶V：Mr：相對分子質(zhì)量；與0 μmol/L H2O2組比較，aP<0.05，bP<0.01

TRPML1：transient receptor potential mucolipin- 1；CTSB：cathepsin B；CTSD：cathepsin D；CTSL：cathepsin L；CTSV：cathepsin V；Mr：relative molecular mass；aP<0.05，bP<0.01 compared with 0 μmol/L H2O2group

A.BV2 細胞用不同濃度H2O2處理6 h胱抑素C mRNA 水平；B.BV2 細胞用不同濃度H2O2處理6 h，TRPML1 mRNA水平；C.BV2 細胞用不同濃度H2O2處理6 h，TRPML1、CTSB、CTSD、CTSL、CTSV蛋白表達

A.cystatin C mRNA level in BV2 cells treated with different concentrations of H2O2for 6 hours；B.TRPML1 mRNA levels of BV2 cells treated with different concentrations of H2O2for 6 hours；C.protein expressions of TRPML1，CTSB，CTSD，CTSL and CTSV in BV2 cells treated with different concentrations of H2O2for 6 hours

圖2過氧化氫作用于BV2細胞后對TRPML1蛋白和多種組織蛋白酶的影響

Fig2Effects of hydrogen peroxide on TRPML1 protein and various cathepsins in BV2 cells

CTSB通過Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3信號通路和絲裂原活化蛋白激酶信號通路抑制人類SHSY5Y細胞生長、誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生[14]。有研究顯示在BV2細胞中H2O2誘導(dǎo)IL- 1β的分泌是以NLRP3炎癥小體依賴的方式進行；與正常對照組相比，AD患者血漿中的CTSB活性、IL- 1β和丙二醛顯著升高[5]。CTSB作用于一定的底物后也能產(chǎn)生N-截短的聚谷氨酸-β淀粉樣蛋白(poly-glutamate-beta-amyloid，pGlu-Aβ)，而pGlu-Aβ已被證明是多種形式的Aβ肽中神經(jīng)毒性很強的肽。另外，CTSB抑制劑E64d能夠降低pGlu-Aβ和其他相關(guān)Aβ肽的產(chǎn)生[10]；在針對神經(jīng)性炎癥的發(fā)生發(fā)展方面，推測CTSB抑制劑CA- 074Me與E64d可能有類似作用。筆者認為組織蛋白酶B 誘導(dǎo)的神經(jīng)性炎癥變化在本質(zhì)上是一種免疫性炎癥反應(yīng)；免疫反應(yīng)適當(dāng)時可能具有神經(jīng)保護作用，免疫反應(yīng)過度時則會誘導(dǎo)或加重AD的發(fā)生。有學(xué)者通過對BV2細胞中不同處理組的細胞生長情況進行分析，認為CTSB對NLRP3炎癥小體的激活調(diào)控需要鈣離子信號的介導(dǎo)；然而，鈣離子信號本身或可能通過其他途徑的活化信號激活NLRP3炎癥小體；鈣離子信號的傳導(dǎo)在上游、起始端到復(fù)合體的組裝等環(huán)節(jié)均調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活化[6]；推測在一定條件下，CTSB基因能夠通過NLRP3炎癥小體的信號通路調(diào)節(jié)BV2細胞的生長和凋亡。

siScr：小干擾；siRNA：小干擾RNA

siScr：small interfering scramble；siRNA：small interfering RNA

A.TRPML1 siRNA有效地沉默TRPML1表達；B.TRPML1 siRNA 顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的CTSB蛋白表達

A.TRPML1 siRNA effectively silenced TRPML1 expression；B.TRPML1 siRNA significantly inhibited the protein expression of H2O2-induced CTSB

圖3沉默TRPML1表達水平影響H2O2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子EB蛋白和CTSB蛋白表達

Fig3Silencing of TRPML1 expression level affects H2O2-induced transcription factor EB and CTSB protein expressions

來自溶酶體的組織蛋白酶的分泌通過半胱天冬酶依賴性和半胱天冬酶非依賴性途徑參與溶酶體膜透化介導(dǎo)的細胞死亡。由溶酶體的破裂或者晶體的吞噬作用所觸發(fā)的CTSB的釋放將會導(dǎo)致NLRP3炎性小體的激活、并導(dǎo)致促炎細胞因子IL- 1β和IL- 18的分泌，這些作用過程與AD的發(fā)病有關(guān)[15]。Colletti等[16]認為溶酶體離子通道蛋白TRPML1的缺失很可能會導(dǎo)致CTSB依賴性的細胞凋亡；他們發(fā)現(xiàn)在TRPML1 基因被沉默后，溶酶體CTSB易位到細胞質(zhì)中，由Bax介導(dǎo)而引發(fā)細胞凋亡；由于Bax活性的抑制不阻止CTSB的釋放，表明該蛋白質(zhì)位于CTSB的下游；推測細胞色素C的釋放、線粒體的滲透和半胱天冬酶的切割是隨后強化細胞凋亡發(fā)生的因素。本研究顯示，ROS能上調(diào)溶酶體鈣離子通道蛋白TRPML1和組織蛋白酶B的表達，當(dāng)用不同濃度的H2O2處理BV2細胞時，發(fā)現(xiàn)CTSB與TRPML1蛋白均有相似或同步的變化；而在200 μmol/L處理組與正常對照組比較，TRPML1 mRNA表達明顯增加，提示在BV2的氧化應(yīng)激損傷模型中，CTSB對NLRP3炎癥小體的活化作用有可能與TRPML1基因的表達相關(guān)聯(lián)。胱抑素C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，相關(guān)基因能在所有的有核細胞內(nèi)以恒定速度持續(xù)轉(zhuǎn)錄與表達，并無組織特異性。本研究顯示胱抑素C的mRNA 表達水平在處理組與對照組之間無差異。CTSB是一類半胱氨酸蛋白酶家族，在人體中有11亞類[17]，本研究顯示H2O2顯著上調(diào)TRPML1和CTSB表達，比較輕微上調(diào)CTSD表達，但不影響CTSL和CTSV；推測ROS可能是通過TRPML1激活CTSB而不破壞溶酶體膜，結(jié)果不涉及其他類型組織蛋白酶。推測H2O2處理BV2細胞時誘導(dǎo)的CTSB和TRPML1蛋白增加可能有一定的組織特異性。

CTSB在一定條件下具有活化NLRP3炎癥小體的作用，這種作用是否受到溶酶體鈣離子通道蛋白TRPML1的影響？Man和Kanneganti[18]認為，CTSB與TRPML1在溶酶體中通過相互作用，從而維持轉(zhuǎn)錄因子EB的抑制并降低自噬相關(guān)蛋白的表達。Qi等[19]研究顯示CTSB的遺傳缺失或藥理學(xué)抑制將會通過下調(diào)雷帕霉素的作用或者通過TRPML1激活TFEB觸發(fā)信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致溶酶體生物合成的增加和自噬作用的增強。本研究顯示沉默TRPML1基因表達后能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的CTSB表達，H2O2處理組與正常對照組比較，CTSB或TFEB蛋白的表達均顯著增加；而H2O2+siRNA 組與H2O2組比較，CTSB蛋白的表達顯著減少。另外，Tseng等[20]研究顯示溶酶體鈣離子信號通過TFEB在人單核細胞中調(diào)節(jié)高葡萄糖介導(dǎo)的IL- 1β分泌。本研究在檢測CTSB蛋白的同時同步檢測TFEB，發(fā)現(xiàn)有類似的表達增強，進一步支持TRPML1基因沉默后的病理生理作用涉及到轉(zhuǎn)錄因子對CTSB基因的表達調(diào)控?？傊?，CTSB在小膠質(zhì)細胞中通過鈣離子信號通路的介導(dǎo)能夠活化NLRP3炎癥小體，通過抑制CTSB活性或沉默TRPML1基因的表達有可能控制ROS對神經(jīng)性炎癥的促進作用。