袁周陽(yáng)，張 昱，馬倩倩，周義玲，汪曉洲，紀(jì)巧榮，曹成珠，劉 杰，穆罕默德·杰馬，張 偉，2，3*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心；3.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001)

無論是急進(jìn)高原的人群還是航空、航天作業(yè)中突發(fā)急性缺氧的人群，急性低氧應(yīng)激的代償都對(duì)機(jī)體適應(yīng)突變的外界環(huán)境起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，主要影響心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)。目前低氧應(yīng)激早期循環(huán)系統(tǒng)血流分布情況不明，其對(duì)深入研究高原病的發(fā)生發(fā)展和航空、航天醫(yī)學(xué)研究造成了障礙。本研究主要通過給予小鼠急性低氧通氣模擬急性低氧應(yīng)激刺激，采用彩色微球技術(shù)來觀察刺激狀態(tài)下小鼠主要臟器的血流分布情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)選用BALB/c雄鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)為：SCXK(京)2016-0006號(hào)]，分對(duì)照組和低氧組，每組8只，體重26±2 g。小鼠均置于24 ℃、晝夜交替、自由飲食飲水條件下飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑選擇

彩色微球(黃色，紅色，藍(lán)色)DYE-TRAK購(gòu)于Triton Technology 公司；Tween80和Triton X-100購(gòu)于Solarbio公司，硫柳汞購(gòu)于上海中秦化學(xué)試劑有限公司，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)購(gòu)于Aladdin公司，無水乙醇購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司，戊巴比妥鈉購(gòu)于上海泰瑞爾生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器選擇

Power Lab生物信號(hào)采集系統(tǒng)、壓力傳感器購(gòu)于AD Instruments公司，呼吸機(jī)(950 North Hague Avenue Columbus，Ohio 43204-2121 U.S.A)購(gòu)于Columbus Instruments公司，酶標(biāo)儀(infinite M200 PRO)購(gòu)于TECAN公司，手持式血液分析儀(300-G)購(gòu)于雅培貿(mào)易上海有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)

小鼠于術(shù)前12 h禁食，用1%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉后固定于小鼠體溫維持操作板，做小鼠氣管插管及右頸總動(dòng)脈插管，將聚乙烯導(dǎo)管(ID 0.3mm，OD 0.5mm)經(jīng)右頸總動(dòng)脈置入左心室。通過Power Lab生物信號(hào)采集系統(tǒng)監(jiān)測(cè)小鼠左心室壓，判定導(dǎo)管已到達(dá)心室腔。將小鼠氣管插管連接呼吸機(jī)，設(shè)置潮氣量為6.5 mL/kg。對(duì)照組小鼠通入室內(nèi)空氣(西寧地區(qū)，大氣壓582mmHg，PO2121.6mmHg)，低氧組通入15%氧氣濃度的混合氣體(15% O2，85% N2)。兩組于通氣1、3 min末通過左心室插管向心室勻速注入黃色、紅色微球制備液100 μL(微球數(shù)約60000個(gè))后，立即用適量肝素生理鹽水沖管，待微球穩(wěn)定5 min，腹腔注射過量麻醉藥品處死小鼠。

1.5 臟器組織處理

取小鼠心、腦、肺、肝臟和腎臟組織，用半干濾紙吸凈臟器組織上的多余血液，置于15 mL離心管稱量。組織處理方法參照Hakkinen[1]和粱斌[2]等的方法。首先向各組織樣本中加入100 μL含5 000個(gè)藍(lán)色微球的微球質(zhì)控液，作為回收率測(cè)定的質(zhì)控物。向各個(gè)離心管中加入12 mL濃度為1 mol/L的KOH溶液，混勻后放置于60 ℃水浴鍋過夜(12h)。期間需開蓋釋壓、渦旋，待組織器官完全消化溶解后，離心(1500g)15 min后用吸管抽棄上清液至距管底1 cm高度，勿擾動(dòng)管底微球。加入50 ℃蒸餾水12 mL，混勻后離心(1500g)5 min，棄上清液至管底1 cm處。再加入10% TritonX-100試劑12 mL，離心(1500g)5 min后棄上清液(腦組織處理需使用15% TritonX-100試劑12mL，重復(fù)兩次)。最后每管先后加入酸化乙醇和無水乙醇12 mL，離心(1500g)5 min后棄上清液，打開離心管蓋存放在避光處，至無水乙醇于室溫下完全蒸發(fā)。單獨(dú)制備6個(gè)藍(lán)色微球的100%回收標(biāo)準(zhǔn)管，每管加入相應(yīng)含5 000個(gè)藍(lán)色微球的質(zhì)控液100 μL，加入無水乙醇6 mL，離心(1500g)5 min后抽棄上清液，避光開蓋待干燥后測(cè)其標(biāo)準(zhǔn)管藍(lán)色微球吸光度值，作為標(biāo)準(zhǔn)管的OD值。

向已干燥的離心管中加入DMF試劑150 μL，靜置15 min后渦旋15 min，待微球染料充分被萃取。離心(1500g)5 min后小心取出離心管。用移液槍吸取100 μL提取液到96孔板中。設(shè)置波長(zhǎng)：黃光448 nm、紅光535 nm、藍(lán)光672 nm。分別檢測(cè)組織樣本提取液在不同最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算組織臟器相對(duì)血流量。

1.6 動(dòng)脈血?dú)夥治?/h3>

另取小鼠建立氣管插管通道，采用右側(cè)頸總動(dòng)脈插管法在低氧通氣前、低氧通氣1 min、低氧通氣3 min時(shí)取動(dòng)脈血約90 μL行動(dòng)脈血?dú)夥治觥?/p>

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 微球回收率情況

圖1顯示，標(biāo)準(zhǔn)管和各組織樣本回收微球吸光度情況，藍(lán)色微球標(biāo)準(zhǔn)管(STDS)平均吸光度值為0.2330(標(biāo)準(zhǔn)差0.007)AU(作為100%回收率)。實(shí)驗(yàn)所測(cè)得組織樣本微球回收率在84.86%到92.05%之間，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 各組織臟器藍(lán)色質(zhì)控微球染料回收吸光度結(jié)果圖Figure 1 Mean absorbance of dye extracted from blue microspheres isolated from tissues of mice

2.2 小鼠器官相對(duì)組織血流量結(jié)果

表1顯示，通氣3 min和1 min時(shí)相比，各個(gè)器官組織血流量有所降低(除低氧組肺營(yíng)養(yǎng)血管血流量外)，但與對(duì)照組相比，低氧1 min和3 min的相對(duì)血流量趨勢(shì)大致相同。

血流測(cè)量結(jié)果顯示，急性低氧應(yīng)激時(shí)腦血流量明顯增加(P<0.05)、心肌組織血流量有所升高但無顯著差異(P>0.05)、肺營(yíng)養(yǎng)血管血流量有所升高但無顯著差異(P>0.05)、肝組織血流量明顯降低(P<0.05)、腎組織血流量升高(P<0.05)。

表1 小鼠器官相對(duì)血流量結(jié)果Table 1 The resul to frelative blood flow in

續(xù)表：

2.3 通氣1 min到3 min小鼠器官組織血流量降低結(jié)果

表2顯示，通氣3 min和1 min時(shí)相比，在腦血流降低量(0.0130±0.0066，0.0138±0.0038，P>0.05)、心肌血流降低量(0.0458±0.0822，0.0456±0.0400，P>0.05)、肝臟血流降低量(0.0031±0.0025，0.0020±0.0011，P>0.05)以及腎血流降低量(0.0914±0.0552，0.0894±0.0450，P>0.05)上，對(duì)照組和低氧組均無顯著差異，肺營(yíng)養(yǎng)血管血流降低量(0.0073±0.0052，0.0006±0.0025，P<0.05)在低氧組明顯低于對(duì)照組。

表2 通氣1min到3min小鼠器官組織血流降低情況Table 2 The changes of blood flow from 1 min to 3min

2.4 常氧通氣、低氧通氣1 min、低氧通氣3 min時(shí)的動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果

表3顯示，常氧與低氧通氣1、3 min時(shí)采集動(dòng)脈血行血?dú)夥治鰧?duì)比，結(jié)果顯示與常氧時(shí)比較，低氧通氣1、3 min時(shí)小鼠動(dòng)脈血pH值無明顯差異，動(dòng)脈血氧分壓(Arterial partial pressure ofoxygen，PaO2)和血氧飽和度(Arterial Oxygen Saturation，SaO2)均降低(P<0.05)；低氧通氣1 min與3 min時(shí)比較，血?dú)夥治鼋Y(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 常氧通氣、低氧通氣1 min、低氧通氣3 min時(shí)動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果Table 3 The results of arterial blood gas under normoxia and hypoxia 1 min and 3

* ：P<0.05，與Normoxia比較；#：P<0.05，與Hypoxia 1 min比較

3 討論

應(yīng)激(stress)作為重要的非特異性防御反應(yīng)，是機(jī)體在受到內(nèi)外環(huán)境的刺激時(shí)出現(xiàn)的一種各系統(tǒng)調(diào)節(jié)動(dòng)員的反應(yīng)[3]。發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)(hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system，HPA)和交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(sympathetic cadrenal medulla system)被激活，對(duì)機(jī)體有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。本研究采用在海拔2 260米、大氣壓582 mmHg、氧分壓87.3 mmHg下的西寧地區(qū)向?qū)嶒?yàn)小鼠通入15% O2和85% N2的混合氣體(相當(dāng)于海平面11%的O2含量)開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，其中氧氣濃度是課題組前期研究的有效低氧應(yīng)激氧氣濃度[5]。對(duì)照組及低氧組均采用氣管插管連接呼吸機(jī)通氣，保證通氣的頻率及深度，排除了由于缺氧引起過度通氣導(dǎo)致CO2分壓改變對(duì)血流量的影響[6]。實(shí)驗(yàn)通過呼吸機(jī)給小鼠通入室內(nèi)空氣和低氧氣體并選取頸外動(dòng)脈采集動(dòng)脈血[7]行血?dú)夥治鼋Y(jié)果對(duì)比，達(dá)到了研究急性低氧應(yīng)激小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

測(cè)量血流量的方法很多，常用的方法有超聲多普勒測(cè)血流法、激光多普勒血流檢測(cè)法、二氧化碳費(fèi)克法、彩色微球測(cè)血流法等[8，9]。本實(shí)驗(yàn)采用彩色微球法可以測(cè)量多個(gè)組織臟器在同一時(shí)刻的血流量。彩色微球是一種直徑為15 μm的聚苯乙烯小球，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左心室注入微球混懸液，微球隨體循環(huán)血液被運(yùn)送至各個(gè)組織臟器并嵌頓于其毛細(xì)血管中，通過臟器組織處理，回收微球并萃取其表面染料，再通過紫外分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀來檢測(cè)微球染料在不同最大吸收波長(zhǎng)處的OD值，根據(jù)公式計(jì)算組織臟器相對(duì)血流量，所測(cè)OD值與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器相對(duì)血流量呈正比關(guān)系。彩色微球法不僅可一次性測(cè)量同一時(shí)刻多個(gè)臟器的血流量，還可序貫測(cè)定同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)歷多種條件時(shí)的臟器血流變化，且彩色微球與放射微球相比具有無輻射、易儲(chǔ)存等特點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可的一種測(cè)血流量的經(jīng)典方法[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，急性低氧通氣時(shí)，腦、腎血流顯著升高，心肌血流量有所升高，肝血流量明顯下降。在注入微球1 min至3 min血流量變化結(jié)果中，3 min血流量較1 min普遍降低，但各組變化趨勢(shì)大致相同。我們推測(cè)是由于1 min時(shí)注入的微球在臟器組織造成了一定程度的嵌頓，導(dǎo)致3 min血流量整體下降；但低氧應(yīng)激時(shí)的肺營(yíng)養(yǎng)血管血流在1 min至3 min時(shí)降低不明顯，與對(duì)照組相比，1 min至3 min的血流降低量明顯小于對(duì)照組，提示低氧應(yīng)激時(shí)肺營(yíng)養(yǎng)血管的血流量反而增加。

由于實(shí)驗(yàn)通過呼吸機(jī)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低氧通氣，因此可排除低氧通氣反應(yīng)、低碳酸血癥血管收縮反應(yīng)等因素造成的血流變化，低氧血管舒張反應(yīng)可能是引起腦、腎血流升高的原因。有研究表明低氧能擴(kuò)張人類大腦中動(dòng)脈、頸動(dòng)脈以及椎動(dòng)脈[11]。缺氧時(shí)，腦血流的補(bǔ)償性增加足以維持腦氧輸送。低氧對(duì)腦血流影響的潛在機(jī)制較復(fù)雜，涉及諸多生理學(xué)因素，存在代謝和生化過程的相互作用。腦血管擴(kuò)張的機(jī)制可能會(huì)和低氧暴露程度、持續(xù)時(shí)間，大腦對(duì)O2、CO2和pH變化的反應(yīng)性以及局部釋放血管活性因子的程度有關(guān)[12，13]。有關(guān)腎臟在急性低氧時(shí)血流量的變化研究較少，主要為新生兒窒息與腎血流相關(guān)性的研究，結(jié)果表明窒息缺氧時(shí)新生兒腎血流灌注阻力增大、流速減慢導(dǎo)致腎血流灌注減少[14]。因其選用的研究對(duì)象為出生大于24 h的窒息兒，與本研究選用的急性低氧通氣3 min小鼠無論從研究對(duì)象還是缺氧情況都具有巨大差異。非神經(jīng)系統(tǒng)器官肝臟在低氧應(yīng)激時(shí)血流量下降，可能與肝血管中分布的介導(dǎo)血管收縮受體及受體密度不同導(dǎo)致低氧應(yīng)激時(shí)肝臟血流降低有關(guān)。肺組織所測(cè)血流量為微球嵌頓在肺營(yíng)養(yǎng)血管中所測(cè)得血流情況，各臟器組織3 min較1 min血流量均降低但低氧應(yīng)激時(shí)的肺營(yíng)養(yǎng)血管血流1 min到3 min無明顯變化，推測(cè)低氧應(yīng)激可調(diào)節(jié)肺營(yíng)養(yǎng)血管使血流增加，保證在急性低氧應(yīng)激時(shí)肺組織的血氧供給量[5，15]。

綜上所述，急性低氧應(yīng)激作為一種外界刺激因素能夠影響小鼠臟器組織血流分布，使腦、腎和肺營(yíng)養(yǎng)血管血流升高，肝血流降低。這種變化可能與低氧應(yīng)激時(shí)組織臟器血流重新分布，優(yōu)先供應(yīng)重要臟器有關(guān)。