嚴云飛，靳國恩，曹成珠，李曉娜，米國霞， 李生花

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，五味沉香散(沉香、黃芪、川芎、酸棗仁、甘草)具有抗缺氧作用，但無理論依據(jù)。本研究通過相關(guān)實驗設(shè)計，明確其相關(guān)作用及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SCXK(陜)2017-003]。隨機分為低氧組(生理鹽水組，NS)、陽性對照組(紅景天組，HJT)、低氧藥物組(五味沉香散組，WW)，每組10只，均置低壓氧艙(模擬海拔5500m的低氧環(huán)境)中，30 d后取出腦組織，通過免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附實驗法行HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2水平測定，同時制作腦組織形態(tài)學(xué)切片。

1.1.2 主要儀器、試劑

低壓氧艙購自中航風雷公司；電泳儀、電泳槽、ECL發(fā)光液購自Bio-Rad公司；RIPA、PMSF、4%多聚甲醛(815B0215)、2.5%電鏡固定液(P1126)均購自索萊寶公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏公司；BCA蛋白定量試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒(E-EL-R0513c)購自武漢伊萊瑞特生物公司；PVDF膜購自Mil-Lipore公司；HIF-1α(ab179483)購自abcam公司；Beclin- 1 Antibody(ab6721)、Bcl-2(ab6940)購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附實驗方法

將標準品工作液依次加入兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μL(若樣本濃度高于檢測范圍，需用標準品、樣本稀釋液稀釋后取樣)。酶標板覆膜：于每個孔中加入生物素化抗體工作液100 μL混勻，酶標板加上覆膜，孵育(37℃)90 min。甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350 μL，浸泡1～2 min，吸去或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干，重復(fù)此洗板步驟3次。每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，覆膜，溫育(37℃)30 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每孔加90 μL底物溶液(TMB)，覆膜，避光孵育(37℃)15 min左右。加終止液(50μL)終止反應(yīng)即刻用酶標儀在450 nm波長處測量各孔的光密度(OD值)。

1.2.2 免疫組化方法

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，進行方差分析，三組間兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 慢性低氧對三組大鼠腦組織Bcl-2、HIF-1α、Beclin-1水平的影響

慢性低氧對三組大鼠腦組織Bcl-2、HIF-1α、Beclin-1水平的影響結(jié)果見表1。

表1 低氧30天三組大鼠腦組織Bcl-2、HIF-1α、Beclin-1 水平(OD值)Table 1 Brain tissue Bcl-2，HIF-1α and Beclin-1 levels of three groups of rats at 30 days of

* ：與NS比較，P<0.05

表1顯示，五味沉香散組Bcl-2水平顯著高于生理鹽水組(P<0.05)。五味沉香散組HIF-1α水平顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。五味沉香散組Beclin-1水平顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。提示在低氧環(huán)境中五味沉香散可降低大鼠腦組織HIF-1α、Beclin-1的表達，同時可增高Bcl-2的表達，即可增加抗凋亡基因的表達，降低促凋亡因子及低氧誘導(dǎo)因子的表達，起到抗凋亡、缺氧的作用。

2.2 慢性低氧對三組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

圖1 低氧30天三組大鼠腦組織切片圖(×40)Figure 1 Slides of brain tissue in three groups of rats at 30 days of hypoxia(×40)

圖1顯示：

Beclin-1在生理鹽水組細胞數(shù)量最多，細胞排列最亂；在紅景天組細胞數(shù)量稍有下降，細胞排列稍整齊；在五味沉香散組細胞數(shù)量最少，細胞排列最為整齊。

Bcl-2在生理鹽水組細胞數(shù)量最少，細胞排列紊亂；在紅景天組細胞數(shù)量稍有增多，細胞排列紊亂；在五味沉香散組細胞數(shù)量最多，細胞排列整齊。

HIF-1α在生理鹽水組細胞數(shù)量最多，細胞排列最亂；在紅景天組細胞數(shù)量稍有下降，細胞排列紊亂；在五味沉香散組細胞數(shù)量最少，細胞排列整齊。

3 討論

本研究探討五味沉香散對慢性低氧大鼠海馬神經(jīng)細胞損傷的保護作用，通過五味沉香散對HIF-1α活性及大腦海馬組織中Beclin-1、Bcl-2表達的影響，確認其功效并初步考察作用機制。

內(nèi)環(huán)境氧濃度的平衡是機體進行正常有氧代謝的必要條件，當暴露于低氧環(huán)境中，機體會立即產(chǎn)生應(yīng)激和耐氧適應(yīng)性反應(yīng)，如心率加快、頭暈乏力、昏厥甚至窒息死亡等。HIF-1作為高度特異性的核轉(zhuǎn)錄因子，在細胞感知和適應(yīng)內(nèi)環(huán)境氧分壓變化的過程中，發(fā)揮著重要的作用[1]。它是一種異源二聚體，主要由120 kD的HIF-1α和91～94 kD的HIF-1β兩個亞單位組成，在低氧環(huán)境中，HIF-1的表達明顯增多。Bcl-2是一種抑制凋亡的線粒體內(nèi)膜蛋白，具有抗細胞凋亡的功能[2]，基因及其表達蛋白可抑制多種細胞的凋亡，所以稱其為凋亡抑制基因。Bcl-2在正常的套區(qū)和邊緣帶中小B淋巴細胞和一些T細胞中有表達， 其表達和調(diào)控是影響細胞凋亡的關(guān)鍵因素之一；它能夠阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)，參與細胞凋亡的調(diào)控，抑制細胞凋亡。Bcl-2抗細胞凋亡的作用機制可能與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管內(nèi)鈣離子釋放有關(guān)[3]。Beclin-1基因也稱BECN1基因，是一種自噬相關(guān)基因，在自噬中發(fā)揮重要作用[4]，Beclin-1基因是參與自噬調(diào)控的重要因子，已證實在多種腫瘤組織及低氧組織中呈低水平表達[5]，它與Bcl-2基因相互拮抗調(diào)控自噬。

本研究將大鼠置于海拔5 500 m的模擬低氧環(huán)境中，分別用生理鹽水、五味沉香散及紅景天灌胃發(fā)現(xiàn)：暴露低氧30 d，五味沉香散組和紅景天組的HIF-1α及Beclin-1的水平均明顯低于生理鹽水組，與生理鹽水組相比具有顯著性差異；而五味沉香散組和紅景天組Bcl-2的水平明顯高于生理鹽水組，與生理鹽水組相比具有顯著性差異。說明在低氧條件下，五味沉香散可以降低Beclin-1及HIF-1α的表達，促凋亡基因Beclin-1表達減少，提示此藥物對細胞有保護、修復(fù)的作用；HIF -1α表達降低，提示此藥物具有抗缺氧的作用；Bcl-2表達增高，提示此藥物可以抑制神經(jīng)元凋亡對腦細胞起保護作用。

綜上所述，五味沉香散對慢性低氧大鼠海馬神經(jīng)細胞損傷有修復(fù)和保護作用。