王卓亞，楊發(fā)滿，汪雪萍，旦增諾揚(yáng)

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

大量研究表明慢性高原病(Chronic Mountain Sickness，CMS )患者凝血功能異常，發(fā)生血栓和出血的風(fēng)險均升高[1-3]。慢性高原病出血風(fēng)險增高與凝血因子減少和血小板減少有關(guān)，慢性高原病血栓形成與什么有關(guān)目前了解有限。本研究旨在了解EMP和P-選擇素與慢性高原病患者發(fā)生血栓的關(guān)系。

內(nèi)皮細(xì)胞微粒(Endothelial Microparticles，EMPs)是內(nèi)皮細(xì)胞在激活或凋亡狀態(tài)下所釋放的微小、不含細(xì)胞核的囊泡狀物質(zhì)，大量研究證實(shí)EMPs可以反映內(nèi)皮細(xì)胞的損傷狀況[4-5]，CMS患者由于缺氧，可使血管內(nèi)皮廣泛受損，從而可能促進(jìn)炎癥因子的釋放致凝血系統(tǒng)激活，促進(jìn)血栓形成。P-選擇素(P-selectin)是PLT活化時釋放于血漿中介導(dǎo)活化PLT和內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用，是PLT活化釋放的特異標(biāo)志物，其水平升高與血栓的發(fā)生密切相關(guān)[6]。本研究擬通過相關(guān)方法明確慢性高原病患者發(fā)生血栓與血漿EMP、P-選擇素水平之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 樣本選擇

選取2016年12月～2018年9月入住青海大學(xué)附屬醫(yī)院的慢性高原病合并深靜脈血栓患者20例入CMS+T組(年齡46.00±8.60歲，海拔3216.5±332.8米)、慢性高原病患者40例入CMS組(年齡45.63±9.34，海拔3387.5±413.1米)；選取同期就診我院的世居高原健康體檢者(海拔2500米及以上)40例入高原control組(年齡43.83±11.12歲，海拔3228.5±314.6米)。以上受試者均為漢族、男性，各組間年齡、居住海拔無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。慢性高原病標(biāo)準(zhǔn)符合2004年慢性高原病青海標(biāo)準(zhǔn)[7]。對慢性高原病組有深靜脈血栓癥狀的患者，完善下肢靜脈CTV和肺動脈CTA檢查以確診深靜脈血栓排除肺栓塞。CMS患者排除真性紅細(xì)胞增多癥、骨髓增殖性疾病及由于肺部疾患及睡眠障礙導(dǎo)致的繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥。所有受檢者近3月均未使用影響凝血功能及血小板功能藥物。本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審查同意，所有患者及志愿者均已簽署書面同意書。

1.2 血常規(guī)及凝血指標(biāo)測定

所有受檢者抽取空腹靜脈血2 mL于EDTA管中，應(yīng)用全自動血細(xì)胞分析儀(SYSMEXXE-2100)測定血常規(guī)；高原對照組抽取2 mL靜脈血，CMS患者抽取3.6 mL于檸檬酸鈉管中用全自動凝血功能儀(SYSMEX-CA7000)測定凝血功能。

1.3 EMPs水平測定

所有受檢者在治療前抽取空腹靜脈血5 mL于EP管中，離心(160g，20min)獲取富血小板血漿，吸取上層(2/3)血漿離心(1000g，20min)獲取乏血小板血漿。將特異性熒光標(biāo)記抗體(anti-CD31-PE，anti-CD42-FITC)0.5 μg或等量的同型對照抗體加入到50 μL的乏血小板血漿中，室溫孵育30 min，隨后加入1 mL PBS液后采用流式細(xì)胞儀(美國BD公司-FACSCantoII )檢測，標(biāo)本上機(jī)前用0.1～1.0 μm的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行前項角設(shè)門，門內(nèi)收集的微粒進(jìn)行FITC和PE熒光強(qiáng)度分析。EMPs定義為直徑0.1～1.0 μm且CD31+/42b-的微粒。

1.4 P-選擇素測定

所有受檢者未治療前抽取肘靜脈血5 mL，離心(1000g，10min)取血漿于EP管中，用P-選擇素試劑盒(上海遠(yuǎn)慕)測定標(biāo)本血漿含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩個變量之間的關(guān)系采用Pearson直線相關(guān)分析，危險因素采用Logistic回歸，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 三組間的血紅蛋白、血小板和凝血功能與EMPs、P-選擇素水平比較

CMS+T組及CMS組血紅蛋白明顯高于control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CMS+T組及CMS組之間血紅蛋白水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。血漿EMPs、P-選擇素水平在高原對照組和CMS、CMS+T組均依次升高，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見圖1-1～3；CMS+T 組D-二聚體水平高于CMS組和Control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；③CMS組和CMS+T組PT、APTT長于Control組(P<0.05)，CMS組和CMS+T組PLT低于Control組(P<0.05)，慢性高原病合并血栓組與CMS組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組之間EMPs、P-選擇素、Hb、PLT和凝血指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of EMPs，P-selectin，PLT and coagulation indicators among three

* ：與CMS組比較，P<0.05；△：與對照組比較，P<0.05

1-1 CMS+T組EMPs水平1-2 CMS組EMPs水平1-3 control組EMPs水平

上述結(jié)果提示慢性高原病患者無論是否合并血栓與高原健康組比較，其血小板減少，PT、APTT延長，提示慢性高原病患者存在凝血功能異常，具有出血傾向；同時EMPs、P-選擇素、D-二聚體升高，提示存在血栓發(fā)生的風(fēng)險，即慢性高原病患者存在出血和血栓的雙重風(fēng)險。D-二聚體在血栓組明顯升高，與其他兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，支持D-二聚體是血栓形成的評估指標(biāo)，但其是血栓形成后的結(jié)果，我們此次研究的目的是確定對血栓的形成的可能影響因素。

2.2 CMS患者發(fā)生血栓的危險因素分析

分析慢性高原病組和慢性高原病合并血栓組患者的臨床資料，EMPs、P-選擇素、Hb的升高可能是血栓的形成原因，PLT減少、PT和APTT延長可能是血栓形成的抑制因素，故將CMS是否發(fā)生深靜脈血栓作為因變量，將EMPs、Hb、PLT、PT、APTT 和P-選擇素作為自變量，并進(jìn)行賦值(表2)做Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，血漿EMPs水平是慢性高原病血栓發(fā)生的獨(dú)立危險因素，OR=9.947，P=0.005，PT是慢性高原病預(yù)防血栓發(fā)生的保護(hù)性因素，OR=0.134，P=0.017(表3)。提示慢性高原病患者隨著血漿EMPs水平升高，發(fā)生血栓的風(fēng)險度升高，隨著PT的延長，發(fā)生血栓的風(fēng)險度降低。臨床上可以通過檢測血漿EMPs、PT來判定該患者發(fā)生血栓的風(fēng)險度。

表2 CMS指標(biāo)變量數(shù)量化及賦值表Table 2 Quantification for variables of chronic mountain sickness

表3 CMS患者發(fā)生血栓的危險因素Table 3 Risk factors for thrombosis in CMS patients

2.3 EMPs、P-選擇素與凝血指標(biāo)的相關(guān)性分析

CMS+T組EMPs水平與P-選擇素呈中度正相關(guān)，EMPs與D-二聚體呈中度正相關(guān)，P-選擇素與凝血指標(biāo)無關(guān)，見圖2～3。

圖2 EMPs和P-選擇素關(guān)系的散點(diǎn)圖Figure 2 Scatter plot of the relationship between EMPs and P-selectin

圖3 EMPs與D-二聚體的散點(diǎn)圖

3 討論

血栓形成的原因有心血管內(nèi)皮系統(tǒng)的受損、血流的紊亂、血液成分的改變等。CMS患者一方面因慢性缺氧刺激導(dǎo)致紅細(xì)胞代償性增加，使血液具有“濃、黏、聚、凝”的特點(diǎn)[8]，血流紊亂易發(fā)生血栓栓塞性疾?。涣硪环矫?，高原低氧可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[9]，激活機(jī)體內(nèi)、外源性的凝血途徑，使血液呈高凝狀態(tài)。因此尋找CMS發(fā)生血栓的危險因素，提前給予干預(yù)治療，對改善CMS 的凝血功能狀態(tài)具有重要的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，EMPs和P-選擇素在高原健康對照組、慢性高原病組、慢性高原病合并血栓組依次升高。血漿中EMPs水平是新近發(fā)現(xiàn)的一種評估內(nèi)皮功能損傷的方法[10]，慢性高原病患者由于長期缺氧導(dǎo)致廣泛內(nèi)皮系統(tǒng)受損[9]，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮屏障作用減弱，信息傳遞及分泌能力下降，擴(kuò)血管物質(zhì)自分泌能力下降，縮血管物質(zhì)相對增加，白細(xì)胞黏附及血小板聚集度增強(qiáng)，抗凝血功能出現(xiàn)障礙，抗血栓作用下降，出現(xiàn)血液的高凝狀態(tài)[11]。本研究中慢性高原病合并血栓患者EMPs 水平最高，提示內(nèi)皮系統(tǒng)受損最為嚴(yán)重，推測其繼而可引起局部血管收縮、白細(xì)胞黏附、炎癥反應(yīng)增重、血小板聚集增強(qiáng)，出現(xiàn)局部血栓。慢性高原病組患者雖然沒有影像學(xué)提示的靜脈血栓，但由于低氧、血流淤滯緩慢，對內(nèi)皮系統(tǒng)仍有一定程度的損傷，所以EMPs在三組間遞減。Logistic回歸結(jié)果提示，EMPs是慢性高原病發(fā)生血栓的獨(dú)立危險因素，相關(guān)性研究提示：EMPs與D-二聚體水平存在一定的相關(guān)性，故在慢性高原病組患者行血漿EMPs檢查對于判斷該類患者發(fā)生血栓的風(fēng)險度有一定的指導(dǎo)意義。

P-選擇素屬于選擇素家族的一種，主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞的棒管狀小體內(nèi)或者血小板α顆粒中。血清中的可溶性 P-選擇素分子是在內(nèi)皮細(xì)胞損傷或血小板活化時釋放到血液中形成的，可作為機(jī)體內(nèi)血栓形成的診斷靶標(biāo)[12]。血漿中P-選擇素基礎(chǔ)水平較低主要來源于血小板，而在疾病狀態(tài)下高水平的P-選擇素水平則主要由活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌[13]和活化的血小板釋放，使得血清可溶性 P-選擇素表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)而介導(dǎo)血小板或血管內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的相互黏附作用，最終促進(jìn)血管內(nèi)血栓的形成[14，15]，使機(jī)體處于高凝狀態(tài)。在本研究中慢性高原病合并血栓組P-選擇素水平最高，慢性高原病組次之，高原對照組最低，與EMPs在三組間的水平趨勢一致，我們進(jìn)行了EMPs與P-選擇素的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著的中等程度的正相關(guān)，也進(jìn)一步支持了疾病狀態(tài)下高水平的P-選擇素水平主要由活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌和內(nèi)皮受損引起血小板活化所致。同時提示在慢性高原病發(fā)生血栓的風(fēng)險度增高。

此次研究中發(fā)現(xiàn)慢性高原病患者和合并血栓患者血小板減少，分析原因可能與以下因素有關(guān)：①長期缺氧會使巨核細(xì)胞成熟障礙，使巨核細(xì)胞數(shù)目下降[16]，同時紅細(xì)胞和血小板的前體細(xì)胞存在著競爭關(guān)系，慢性高原病患者紅細(xì)胞增多，紅系祖細(xì)胞增殖抑制了巨核系的增殖[17]。②慢性高原病患者血小板活化增多，導(dǎo)致消耗增多[18]。在分析CMS患者形成血栓的危險因素時發(fā)現(xiàn)，血小板水平降低并不是預(yù)防血栓發(fā)生的保護(hù)性因素，可能與部分血小板減少使其活化、消耗過多有關(guān)，而血小板活化是會增加血栓風(fēng)險的。

同時我們還發(fā)現(xiàn)慢性高原病組及慢性高原病合并血栓組PT、APTT延長。據(jù)本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)：慢性高原病患者FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ水平降低，提示慢性高原病患者內(nèi)源性和外源性凝血功能障礙與凝血因子的減少有關(guān)。故慢性高原病患者和同時合并血栓的患者出血風(fēng)險度增高，分析慢性高原病患者發(fā)生血栓的危險因素發(fā)現(xiàn)，PT是血栓發(fā)生的保護(hù)因素，PT越長，提示發(fā)生血栓的風(fēng)險度越低，可據(jù)此指標(biāo)結(jié)合其他指標(biāo)來判斷血栓及出血發(fā)生的風(fēng)險程度。

綜上所述，慢性高原病患者合并血栓患者血漿EMPs、TF-MPs水平升高，血漿EMPs水平與D-二聚體有一定的相關(guān)性。臨床上我們通過動態(tài)監(jiān)測PT、APTT可以判斷出血風(fēng)險度，同時我們可以結(jié)合血漿EMPs、PT來判斷發(fā)生血栓的危險程度。