鮑 金，劉川川，陳辛玲，劉輝琦，劉 杰，曹學(xué)鋒，王生蘭&

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

低氧性肺動(dòng)脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是長(zhǎng)期受慢性低氧等刺激而引起的一系列紅細(xì)胞增多、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥等病理改變，最終導(dǎo)致肺血管重塑的病理過(guò)程。低氧刺激會(huì)使機(jī)體血管活性物質(zhì)分泌失衡，導(dǎo)致肺血管平滑肌細(xì)胞(Pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)異常增殖。HPH發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，但HPH動(dòng)物模型中都存在明顯的PASMCs細(xì)胞增殖和肥大[1-3]，因而調(diào)控PASMCs的細(xì)胞增殖成為HPH研究和藥物開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)[4-8]。

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種分泌型糖基化磷蛋白，廣泛分布在多種組織和細(xì)胞中，在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥大、心力衰竭、肺動(dòng)脈高壓等心血管疾病的發(fā)展中，OPN都起著至關(guān)重要的作用[9-11]。OPN作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它可以通過(guò)與整合素結(jié)合或與CD44結(jié)合來(lái)干擾細(xì)胞增殖、遷移、自噬等過(guò)程。自噬(Autophagy)作為機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，主要通過(guò)溶酶體介導(dǎo)、回收利用細(xì)胞本身的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器[12]維持細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)。OPN對(duì)自噬的調(diào)控是雙向的：OPN可正向調(diào)控自噬增長(zhǎng)[13-15]，也可負(fù)向調(diào)控自噬發(fā)生[16-18]。OPN是血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的標(biāo)志蛋白[19]，對(duì)HPH血管重塑意義重大。有研究發(fā)現(xiàn)OPN可以通過(guò)CD44和p38MAPK通路來(lái)調(diào)節(jié)自噬從而影響平滑肌細(xì)胞功能[20]。但在低氧情況下，OPN是否參與調(diào)控肺血管平滑肌細(xì)胞自噬未見(jiàn)報(bào)道。本課題擬通過(guò)低氧干預(yù)和RNA干擾、過(guò)表達(dá)技術(shù)，探討OPN在低氧下是否能夠調(diào)控PASMCs的自噬發(fā)生，為預(yù)防肺源性心臟病及其肺動(dòng)脈高壓提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原代培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs，課題組凍存品)。α-SMA抗體(武漢博士德公司，中國(guó))，OPN抗體(Abcam公司，美國(guó))，Beclin、LC3B一抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(ABclonal公司，中國(guó))，胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白Marker、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(賽默飛公司，中國(guó))，PVDF膜(Millipore公司，美國(guó))，EdU檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(碧云天公司，中國(guó))，OPN過(guò)表達(dá)及干擾慢病毒(賽業(yè)生物，中國(guó))。超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱(賽默飛公司，中國(guó))，流式細(xì)胞儀(艾森公司，美國(guó))，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士)，蛋白質(zhì)電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司，美國(guó))，離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PASMCs培養(yǎng)

將凍存PASMCs置于37 ℃水浴鍋迅速溶解，離心棄上清液，加入含20%FBS的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱(37℃，3%CO2)培養(yǎng)，每隔3 d換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，以0.25%胰酶(含0.001% EDTA)消化傳代培養(yǎng)。將3～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 PASMCs鑒定

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞分為6組：常氧對(duì)照組(Normoxic)、低氧對(duì)照組(Hypoxia)、低氧+OPN干擾空病毒組(H+OPN EV)、低氧+OPN干擾慢病毒組(H+OPN shRNA)、低氧+OPN過(guò)表達(dá)空病毒組(H+OPN OEV)、低氧+OPN過(guò)表達(dá)慢病毒組(H+OPN shoRNA)。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將處于對(duì)數(shù)期PASMCs(3×106個(gè))接種傳代于35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)到合適濃度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染(干擾序列見(jiàn)表1)。將病毒懸液稀釋為1×108TU/mL，轉(zhuǎn)染滴度定為1×107TU/mL。常氧對(duì)照組加無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基；低氧對(duì)照組加無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基；低氧+OPN干擾空病毒組加OPN空病毒；低氧+OPN干擾病毒組加OPN干擾慢病毒；低氧+OPN過(guò)表達(dá)空病毒組加OPN過(guò)表達(dá)空病毒；低氧+OPN過(guò)表達(dá)病毒組加OPN過(guò)表達(dá)慢病毒。轉(zhuǎn)染12 h時(shí)更換培養(yǎng)液，12 h后置于相應(yīng)培養(yǎng)箱(常氧濃度21%，低氧濃度3%)處理48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 OPN慢病毒干擾序列Table 1 OPN lentivirus interference sequence

1.2.5 細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用EdU法來(lái)評(píng)估細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞(約1×104個(gè))分別接種于24孔板，細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染相應(yīng)OPN處理試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，置于低氧培養(yǎng)箱(3%)處理48 h后移除原培養(yǎng)基，將200 μL包含EdU的新鮮DMEM培養(yǎng)基加入孔中。培養(yǎng)1 h后，移除EdU培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min后將細(xì)胞用含有3%BSA的PBS洗滌兩次，每次5 min。將0.3%Triton X-100浸潤(rùn)(室溫)15 min，然后用Click反應(yīng)液在室溫下避光染色30 min，用Hoechst33342染色15 min。最后，使用Zessis熒光顯微鏡觀察并拍照分析。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

將細(xì)胞(約1×106個(gè))接種于35 mm培養(yǎng)皿，孵育過(guò)夜后，再轉(zhuǎn)染相應(yīng)OPN處理試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞16 h后，將細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱(3%)處理48 h。收集細(xì)胞，用70%冰乙醇在4 ℃下固定12 h。離心除去乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞兩次后染色。細(xì)胞在碘化丙啶溶液中重懸，于室溫下避光孵育20 min。使用流式細(xì)胞儀分析樣本。利用Novo Express軟件對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PASMCs的免疫學(xué)鑒定

α-SMA免疫組化結(jié)果顯示，超過(guò)95%的細(xì)胞均能表達(dá)α-SMA(圖1)。細(xì)胞呈梭形，胞內(nèi)肌絲明顯，鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。

2.2 調(diào)控OPN對(duì)PASMCs細(xì)胞增殖的影響

用EdU法評(píng)估干擾或過(guò)表達(dá)OPN后低氧刺激對(duì)PASMCs細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示：低氧干預(yù)能促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)；與低氧對(duì)照組相比，干擾OPN表達(dá)后其增殖能力減低(P<0.05)；而在OPN過(guò)表達(dá)后細(xì)胞增殖能力未發(fā)生明顯改變(P>0.05)(表2)。

圖1 α-SMA免疫組織化學(xué)染色鑒定圖(A 100×，B 400×)Figure 1 α-SMA immunohistochemical staining(A 100×，B 400×)

表2 調(diào)控OPN對(duì)細(xì)胞增殖的影響Table 2 The effect of OPN on cell

* ：與Normoxic組相比，P<0.05；#：與Hypoxia組相比，P<0.05

2.3 調(diào)控OPN對(duì)PASMCs細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)OPN后PASMCs的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示：與常氧組相比，低氧能促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入S期(P<0.05)；與低氧組相比，OPN被慢病毒干擾后細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(P<0.05)；而OPN過(guò)表達(dá)后細(xì)胞周期無(wú)明顯變化(P>0.05)(圖2，表3)。

圖2 調(diào)控OPN對(duì)PASMCs細(xì)胞周期影響圖Figure 2 The effect of OPN on the cell cycle of PASMCs

表3 調(diào)控OPN對(duì)PASMCs細(xì)胞周期的影響結(jié)果Table 3 The effect of OPN on the cell cycle of

* ：與Normoxic組相比，P<0.05；#：與Hypoxia組相比，P<0.05

2.4 低氧對(duì)PASMCs自噬的影響

為探討低氧對(duì)PASMCs自噬的影響，采用Western Blot法檢測(cè)相關(guān)自噬蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：低氧處理后，能明顯增加OPN表達(dá)(P<0.05)，自噬相關(guān)蛋白Beclin、LC3B表達(dá)也增加(P<0.05)(圖3，表4)。

圖3 低氧對(duì)PASMCs自噬蛋白表達(dá)影響圖Figure 3 Effect of hypoxia on the expression of PASMCs autophagy protein

表4 低氧對(duì)PASMCs自噬蛋白表達(dá)的影響Table 4 Effect of hypoxia on the expression of PASMCs autophagy

2.5 調(diào)控OPN對(duì)PASMCs自噬的影響

為探討低氧下OPN干擾或過(guò)表達(dá)后對(duì)PASMCs自噬的影響，采用Western Blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：與低氧組相比，低氧下OPN被慢病毒干擾后OPN表達(dá)明顯降低(P<0.05)，并引起自噬蛋白Beclin1、LC3B表達(dá)增加(P<0.05)(圖4，表5)；而在OPN過(guò)表達(dá)后OPN表達(dá)明顯增加(P<0.05)，并引起自噬蛋白Beclin、LC3B表達(dá)減少(P<0.05)(圖5，表6)。

圖4 干擾OPN對(duì)低氧下PASMCs自噬蛋白表達(dá)的影響圖Figure 4 Effect of OPN interference on the expression of autophagy protein in PASMCs under hypoxia

表5 干擾OPN對(duì)低氧下PASMCs自噬蛋白表達(dá)的影響Table 5 Effect of OPN interference on the expression of autophagy protein in PASMCs under

* ：與Hypoxia組相比，P<0.05

圖5 過(guò)表達(dá)OPN對(duì)低氧下PASMCs自噬蛋白表達(dá)的影響圖

表6 過(guò)表達(dá)OPN對(duì)低氧下PASMCs自噬蛋白表達(dá)的影響結(jié)果Table 6 Effect of OPN overexpression on the expression of PASMCs autophagy protein under

* ：與Hypoxia組相比，P<0.05

3 討論

HPH是肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertens，PH)的一種常見(jiàn)類型，是低氧刺激導(dǎo)致的肺動(dòng)脈壓力增高，并伴有相應(yīng)結(jié)構(gòu)改變。短時(shí)間急性缺氧引起肺血管收縮，長(zhǎng)時(shí)間慢性缺氧可導(dǎo)致肺血管重塑[21]。而PASMCs細(xì)胞增殖在驅(qū)動(dòng)肺動(dòng)脈高壓血管重塑[22]發(fā)生中有著至關(guān)重要的作用。低氧涉及廣泛的細(xì)胞反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、炎癥等。低氧促進(jìn)PASMCs增殖，此與我們的研究結(jié)果一致。但低氧引起PASMCs細(xì)胞增殖的機(jī)制不明，Zhu B等人發(fā)現(xiàn)MEG3可調(diào)控miR-21/PTEN通路來(lái)影響PASMCs細(xì)胞的增殖[23]。Jihui Lee 等證明miRNA可通過(guò)介導(dǎo)CKI來(lái)影響低氧引起的血管平滑肌的增殖(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)[24]，Gu Q等人研究表明低氧下PASMCs的細(xì)胞增殖可能與干細(xì)胞因子相關(guān)[25]，但低氧到底如何促進(jìn)PASMCs的細(xì)胞增殖，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

OPN作為一種廣泛存在于各種細(xì)胞中帶負(fù)電的磷酸化糖蛋白[26-27]，與心血管疾病、糖尿病和腫瘤密切相關(guān)[28]。OPN可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡和自噬過(guò)程[16]。OPN的表達(dá)被認(rèn)為是VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變的標(biāo)志之一[29]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧可促進(jìn)OPN的表達(dá)，該結(jié)果與其他學(xué)者的結(jié)果不謀而合[30-31]。通過(guò)OPN特異性慢病毒感染OPN表達(dá)后，在低氧下能抑制PASMCs的細(xì)胞增殖，并將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，此與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致[32-33]。但在OPN被過(guò)表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染后，PASMCs在低氧下的增殖并未進(jìn)一步增加，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果也與低氧下無(wú)差異，這可能是OPN與低氧通過(guò)參與相似的機(jī)制對(duì)PASMCs的增殖起促進(jìn)作用。結(jié)果表明，OPN參與了低氧性肺動(dòng)脈高壓血管重塑的形成。

自噬作為機(jī)體一種保守的“自我吞噬”，自噬過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)組分被降解并循環(huán)利用以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[34-36]。在哺乳動(dòng)物中，LC3存在LC3A、LC3B和LC3C等三種亞型，但目前研究最廣的還是LC3B，不少研究都將其視為自噬的關(guān)鍵基因，它與自噬體的成熟相關(guān)，是監(jiān)測(cè)自噬活性的重要蛋白。Beclin是反映自噬活性的重要基因，參與自噬調(diào)控。這兩者能很好地反映自噬的活性。OPN可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬參與許多疾病的發(fā)生。在蛛網(wǎng)膜下腔出血中，OPN可增強(qiáng)自噬、減少凋亡[37]，減輕早期腦損傷；在結(jié)直腸癌中，OPN對(duì)自噬和凋亡都起到抑制作用[16]。由此可見(jiàn)OPN在調(diào)控自噬過(guò)程中表現(xiàn)出雙向作用：既可抑制自噬，也可促進(jìn)自噬的發(fā)生。OPN調(diào)控自噬的機(jī)制復(fù)雜，可能與p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)[16]；也與通過(guò)跟細(xì)胞表面的不同受體結(jié)合，誘導(dǎo)多種基因和信號(hào)通道蛋白的表達(dá)[38-40]有關(guān)；還可與CD44結(jié)合有關(guān)[20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)自噬的研究發(fā)現(xiàn)，單純低氧干預(yù)下自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B表達(dá)增加，表明低氧刺激本身會(huì)引起自噬的發(fā)生，此與其他學(xué)者的研究結(jié)論一致[41-43]。而在低氧情況下使用OPN特異性干擾慢病毒降低OPN表達(dá)后，能促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B的表達(dá)；相反，在使用OPN過(guò)表達(dá)慢病毒后，其抑制了自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B的表達(dá)。由此推斷，OPN對(duì)低氧下PASMCs的自噬過(guò)程有抑制作用，與其他學(xué)者的研究結(jié)論一致[16-18]。OPN調(diào)控低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬并影響細(xì)胞增殖的分子機(jī)制未完全闡明。有研究表明，低氧刺激下能促進(jìn)組織血管新生[44]；而在缺乏自噬蛋白Beclin1的小鼠表現(xiàn)出與低氧有關(guān)的促血管生成表型[45]；在缺氧培養(yǎng)的人肺血管細(xì)胞中，自噬激活抑制了這些血管細(xì)胞的低氧增殖[46]。本研究中，低氧情況下使用OPN特異性干擾慢病毒減低OPN表達(dá)后，能減弱PASMCs細(xì)胞增殖，增強(qiáng)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B表達(dá)。推斷OPN的增強(qiáng)可抑制自噬的激活，從而增強(qiáng)PASMCs細(xì)胞增殖能力。

因此，我們證實(shí)低氧本身能促進(jìn)PASMCs增殖，并誘發(fā)自噬的發(fā)生；同時(shí)OPN參與了低氧下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的自噬過(guò)程。OPN表達(dá)增加可能以直接或間接方式抑制PASMCs自噬發(fā)生，共同促進(jìn)PASMCs增殖。OPN可能是調(diào)控低氧性肺動(dòng)脈高壓肺血管重塑的藥物靶標(biāo)。但OPN調(diào)控低氧誘導(dǎo)的PASMCs自噬的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。