高金亮，趙 楠，張 浩，李偉漢，陳 琛，郭 滿

(1.南陽(yáng)市中心醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，河南 南陽(yáng) 473000；2.南陽(yáng)市中心醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，河南 南陽(yáng) 473000)

乳腺癌是指發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。乳腺癌早期診斷對(duì)于改善患者預(yù)后及延長(zhǎng)生存期具有重要意義，便捷、快速、準(zhǔn)確的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)對(duì)乳腺癌早期診斷至關(guān)重要[2]。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是存在于細(xì)胞外基質(zhì)的磷酸化糖蛋白，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，OPN與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切，是惡性腫瘤生長(zhǎng)的血清學(xué)指標(biāo)之一[3-4]。本研究旨在探討血清OPN水平和乳腺癌組織中OPN表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2012年3月至2017年8月南陽(yáng)市中心醫(yī)院乳腺甲狀腺外科收治的58例乳腺癌患者為研究對(duì)象，患者均為女性，符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診，且入院前均未接受放射治療、化學(xué)治療等。58例乳腺癌患者的年齡33～74(53.14±6.81)歲；腫瘤直徑1.3～5.2(2.84±0.66)cm；腫瘤類型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌31例(Ⅰ級(jí)8例，Ⅱ級(jí)14例，Ⅲ級(jí)9例)，浸潤(rùn)性小葉癌13例，髓樣癌8例，其他類型6例。另選擇同期收治的83例女性乳腺良性腫瘤患者作為對(duì)照，年齡31～76(54.09±7.07)歲；腫瘤直徑1.2～6.3(3.03±0.71)cm；腫瘤類型：乳腺纖維腺瘤61例，乳管內(nèi)乳頭狀瘤17例，小葉增生5例；所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查確診，且在入院前未接受任何治療。2組患者的年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器兔抗人OPN多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，免疫組織化學(xué)染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺染色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；YD-1508R型切片機(jī)(上海之信儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清OPN水平采集患者清晨空腹肘靜脈血5 mL，2 500 r·min-1離心15 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清中OPN水平，試劑盒由美國(guó)R&D公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)腫瘤組織中OPN表達(dá)取乳腺腫瘤組織標(biāo)本，體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟常規(guī)包埋；石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，片厚4 μm；80 ℃烤片2 h，常規(guī)脫蠟、水化；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，每次5 min；采用乙二胺四乙酸 95 ℃ 下抗原修復(fù)15 min，充分暴露抗原；滴加體積分?jǐn)?shù)3%H2O2溶液孵育10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加正常山羊血清封閉 15 min；加入一抗(兔抗人多克隆抗體，PBS稀釋比1100)150 mL，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次 3 min；滴加生物素化二抗工作液，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加SP試劑，室溫孵育 15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色10 min，蒸餾水沖洗10 min，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片；光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。采用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，采用PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。OPN陽(yáng)性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：以腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為OPN陽(yáng)性表達(dá)。高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，共計(jì) 1 000 個(gè)腫瘤細(xì)胞，從陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度2個(gè)方面分別進(jìn)行計(jì)分。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比例計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%為0分，5%～35%為1分，36%～70%為2分，>70%為3分。按腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)顯色為0分，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯示淺黃色顆粒為1分，棕黃色顆粒為2分，棕褐色顆粒為3分。以染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞所占比例得分的乘積作為最終綜合得分，>3分定義為陽(yáng)性，≤3分定義為陰性。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌與乳腺良性腫瘤患者血清OPN水平比較乳腺癌和乳腺良性腫瘤患者血清OPN水平分別為(96.47±24.64)、(31.58±6.19)μg·L-1，乳腺癌患者血清OPN水平顯著高于乳腺良性腫瘤患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.008，P<0.05)。

2.2 乳腺癌與乳腺良性腫瘤組織中OPN表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖1。乳腺癌和乳腺良性腫瘤患者OPN陽(yáng)性表達(dá)率分別為74.14%(43/58)、19.28%(16/83)，乳腺癌患者OPN陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于乳腺良性腫瘤患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=42.226，P<0.05)。

A：乳腺癌組織；B：乳腺良性腫瘤組織。

圖1 乳腺癌與乳腺良性腫瘤組織中OPN表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400)

Fig.1 Expression of OPN in breast cancer and benign breast tumor tissues(immunohistochemistry，×400)

2.3 乳腺癌組織中OPN表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表1。乳腺癌組織中OPN表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，與雌激素受體和孕激素受體表達(dá)無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表1 乳腺癌組織中OPN表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1 Relationship between OPN expression in cancer tissues and clinicopathological features of breast cancer

nOPN/(%)/(%)χ2P ≥2 cm3832(84.21)6(15.79)5.8310.016 <2 cm2011(55.00)9(45.00)TNM Ⅰ、Ⅱ3319(57.58)14(42.42)6.3550.012 Ⅲ、Ⅳ2522(88.00)3(12.00) N0167(43.75)9(56.25) N11915(78.95)4(21.05)7.8070.020 N22319(82.61)4(17.39) Ⅰ125(41.67)7(58.33) Ⅱ3630(83.33)6(16.67)8.3660.015 Ⅲ108(80.00)2(20.00) 3425(73.53)9(26.47)0.0160.899 2418(75.00)6(25.00) 3124(77.42)7(22.58)0.3740.541 2719(70.37)8(29.63)

2.4 血清OPN水平與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表2。血清OPN水平與乳腺癌患者腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，而與雌激素受體和孕激素受體表達(dá)無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表2 乳腺癌患者血清OPN水平與其臨床病理特征的關(guān)系

nOPN/(μg·L-1)tP ≥2 cm3891.48±23.473.2600.002 <2 cm20119.66±42.58TNM Ⅰ、Ⅱ3391.84±33.412.8890.006 Ⅲ、Ⅳ25123.18±49.17 N01672.48±26.18 N11991.44±31.0711.2800.000 N223125.73±43.89 Ⅰ1283.24±21.55 Ⅱ3695.09±23.483.7810.029 Ⅲ10108.55±26.06 34101.15±23.480.3970.693 24103.66±24.11 31104.07±25.740.3420.734 27106.41±26.33

3 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[6]。因此，早期診斷、降低乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是改善患者預(yù)后和生存率的關(guān)鍵[7]。

研究顯示，腫瘤血管形成在乳腺癌生長(zhǎng)、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8]。首先，腫瘤新生血管缺少平滑肌與細(xì)胞間的連接，導(dǎo)致其管壁較薄，基膜不完整，腫瘤細(xì)胞容易借助新生血管基底膜發(fā)生轉(zhuǎn)移[9]；其次，腫瘤新生血管能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲提供所必需的氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及其他所需物質(zhì)[10]。OPN是存在于細(xì)胞外基質(zhì)的一種磷酸化糖蛋白，介導(dǎo)骨組織細(xì)胞與骨基質(zhì)的連接，參與骨基質(zhì)礦化和重吸收過(guò)程[11]。在特定的生理和病理?xiàng)l件下，OPN能夠與多種整合素受體及CD44進(jìn)行結(jié)合，在促進(jìn)腫瘤血管形成、腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用[12]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者OPN陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于乳腺良性腫瘤患者，且乳腺癌患者血清OPN水平顯著高于乳腺良性腫瘤患者；乳腺癌患者血清及腫瘤組織中OPN表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級(jí)有顯著相關(guān)性，而與雌激素受體和孕激素受體表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性。該結(jié)果提示，乳腺癌患者血清及腫瘤組織中OPN呈高表達(dá)，OPN高表達(dá)可能在乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用[13-14]。

綜上所述，OPN在乳腺癌患者血清和腫瘤組織中呈高表達(dá)，其可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有關(guān)，檢測(cè)血清中OPN水平可為乳腺癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供參考。