南 燕，侯妍妍，李玉潔

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院婦產科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

子宮內膜異位癥是生育期女性常見的婦科疾病，生育年齡大、生育次數少者多發(fā)，絕經后使用激素替代治療者也有發(fā)病，患者多以慢性盆腔痛、性交痛、不孕、月經失調等為主要臨床表現[1]，給生育期女性帶來了嚴重困擾。子宮內膜異位癥的發(fā)病機制尚不明確，可能與基因、新生血管形成、炎癥反應、氧化應激、免疫和子宮收縮異常等有關[2]。目前，臨床醫(yī)生多主張盡量給予藥物治療，但臨床上治療子宮內膜異位癥的藥物繁多，只有徹底明確藥物的作用機制，才能保障用藥安全性和合理性。本研究選取造模成功的子宮內膜異位癥大鼠作為研究對象，觀察不同劑量米非司酮對子宮內膜異位病灶及異位病灶中環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取8周齡健康清潔級雌性Sprague Dawley大鼠120只，體質量200～220 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供，確認均為發(fā)情期的性成熟大鼠。

1.2 藥物、試劑與儀器米非司酮藥粉劑(上海麥克林生化科技有限公司)，放射免疫沉淀(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、 二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物有限責任公司)；組織切片機(浙江金華市科迪儀器有限公司)，JY92-II超聲波細胞粉碎機(上海新芝生物技術研究所)，DG-300C電泳儀(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)。

1.3 子宮內膜異位癥模型大鼠制備及分組SD大鼠采用100 g·L-1水合氯醛腹腔麻醉后在尿道口上方腹部做切口，切取部分子宮，置于生理鹽水中，將子宮內膜與肌層分離后，取5 mm×4 mm的內膜組織將其縫于切口邊緣內側血管豐富的腹壁上，4周后再次開腹，在腹壁下發(fā)現顏色異常的漿液性水皰或質硬團塊組織，并經病理組織學證實為存活的異位內膜組織，說明建模成功。選取112只建模成功的大鼠隨機分為模型組及低、中、高劑量米非司酮組，每組28只。模型組大鼠給予1 mL花生油灌胃，每日1次，共4周；低、中、高劑量米非司酮組大鼠分別按1.04、1.24 2.60 mg·kg-1給予米非司酮混懸液灌胃，每日1次，共4周。低、中、高劑量對應臨床用藥分別為10.0、12.5、25.0 mg·d-1，根據實驗動物學藥物計算公式換算得出低、中、高劑量米非司酮組大鼠用藥劑量分別為1.04、1.24、2.60 mg·kg-1。米非司酮混懸液由米非司酮原藥粉加入花生油中形成，質量濃度為1 g·L-1。

1.4 各組大鼠異位內膜組織體積測量模型建立成功后，麻醉大鼠開腹測量大鼠異位內膜組織長、寬、高，根據體積=0.52×長(mm)×寬(mm)×高(mm)[3]，計算異位內膜組織體積。灌胃治療 4 周后，再次剖腹測量并計算異位病灶體積，同時取異位病灶組織，于-80 ℃凍存待用。

1.5 Western blot檢測大鼠異位內膜組織中 COX-2和VEGF蛋白表達將米非司酮干預后所取異位內膜組織碎塊于冰塊上粉碎，加入細胞組織快速裂解液及苯甲基磺酰氟，裂解粉碎，4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，提取組織蛋白，以二喹啉甲酸法進行蛋白定量，制膠，電泳，轉膜，封閉，逐步加入一抗、二抗孵育后曝光鑒定，對膠片進行掃描，結果采用Quantity One分析軟件進行分析，以β-actin 為內參，計算COX-2、VEGF蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠異位內膜組織體積比較結果見表1。模型組大鼠治療后異位內膜組織體積與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；低、中、高劑量米非司酮組大鼠治療后異位內膜組織體積均小于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療前各組大鼠異位內膜組織體積比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，低、中、高劑量米非司酮組大鼠異位內膜組織體積均小于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中、高劑量米非司酮組大鼠異位內膜組織體積小于低劑量米非司酮組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量米非司酮組大鼠異位內膜組織體積小于中劑量米非司酮組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 4組大鼠異位內膜組織體積比較

注：與模型組比較aP<0.05；與低劑量米非司酮組比較bP<0.05；與中劑量米非司酮組比較cP<0.05。

2.2 4組大鼠異位內膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對表達量比較結果見表2和圖1。治療前各組大鼠異位內膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組大鼠治療后異位內膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對表達量與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；低、中、高劑量米非司酮組大鼠治療后異位內膜組織中 COX-2、VEGF蛋白相對表達量均低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低、中、高劑量米非司酮組大鼠異位內膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對表達量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中、高劑量米非司酮組大鼠異位內膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對表達量低于低劑量米非司酮組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量米非司酮組大鼠異位內膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對表達量低于中劑量米非司酮組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 4組大鼠異位內膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對表達量

nCOX-2VEGF28 0.610±0.012 0.618±0.023 0.608±0.0330.610±0.03128 0.613±0.0460.604±0.041 0.487±0.030ab0.485±0.028ab28 0.606±0.0320.624±0.036 0.427±0.027abc0.420±0.024abc28 0.609±0.0360.615±0.086 0.384±0.020abcd0.356±0.023abcd

注：與治療前比較aP<0.05;與模型組比較bP<0.05;與低劑量組比較cP<0.05；與中劑量組比較dP<0.05。

A:模型組；B：低劑量米非司酮組；C：中劑量米非司酮組；D：高劑量米非司酮組。

圖1 4組大鼠異位內膜組織中COX-2、VEGF蛋白表達(Western blot)

Fig.1 Expression of COX-2 and VEGF protein in endometriotic tissues of rats among the four groups(Western blot)

2.3 各組大鼠異位內膜組織中COX-2與VEGF蛋白表達的相關性Pearson相關性分析結果顯示，異位內膜組織中COX-2與VEGF蛋白表達呈正相關(r=0.782，P<0.05)。

3 討論

米非司酮用于治療子宮內膜異位癥已有20多年，其能改善患者盆腔疼痛，并使異位病灶萎縮。LI等[4]研究證實，米非司酮可降低子宮內膜異位癥大鼠異位內膜組織中COX-2基因轉錄，從而降低前列腺素分泌。徐妍等[5]研究顯示，米非司酮可抑制子宮內膜異位癥大鼠異位內膜組織內炎性因子、侵襲基因、凋亡抑制基因的表達，同時增加促凋亡基因的表達。臨床上將米非司酮單獨或聯合其他藥物用于治療子宮內膜異位癥，但是關于劑量的選擇目前尚無統(tǒng)一定論，臨床用藥劑量為5～25 mg，均無明確標準說明治療的最佳劑量。張曉平[6]認為，腹腔鏡手術聯合米非司酮治療子宮內膜異位癥的療效較理想，且安全性高。馮珀霖等[7]研究顯示，醋酸曲普瑞林治療子宮內膜異位癥的作用優(yōu)于米非司酮，其能夠降低復發(fā)率，但是潮熱、圍絕經期癥狀、胃腸道反應等不良反應明顯多于米非司酮，臨床長期用藥應慎重考慮。還有學者采用米非司酮聯合孕三烯酮[8]、米非司酮聯合中藥[9-12]等方案治療了宮內膜異位癥，結果顯示，這些治療方案均能有效改善患者癥狀，減輕盆腔疼痛，降低術后復發(fā)率，且不良反應輕。

COX-2是一種膜結構蛋白，能將花生四烯酸代謝為各種前列腺素產物，可被多種生長因子、細胞因子、脂多糖、腫瘤啟動因子等誘導產生。VEGF與多種腫瘤及炎癥疾病的發(fā)生有關，VEGF在子宮內膜異位癥的發(fā)生中參與新生血管內皮細胞增殖，促進新生血管形成[13-14]，與子宮內膜異位癥的發(fā)病、進展有關。秦江霞等[15]研究顯示，COX-2、VEGF在子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中高表達，與子宮內膜異位血管的生成有關。JANA等[16]研究發(fā)現，基質金屬蛋白酶-2可通過環(huán)氧化酶2-前列腺素E2-磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶途徑參與血管細胞遷移和侵入，在子宮內膜異位癥發(fā)病中起著重要作用。

本研究結果顯示，米非司酮治療后，大鼠體內異位內膜組織體積較治療前明顯減小，異位子宮內膜組織中COX-2、VEGF蛋白表達明顯降低；且給藥劑量越高，上述各指標下降越明顯。本研究還發(fā)現，異位子宮內膜組織中COX-2、VEGF蛋白表達呈正相關。米非司酮可能通過抑制雌激素和炎性因子的產生減少COX-2生成，阻止異位內膜組織中新生血管生成來抑制疾病進展。有研究發(fā)現，低劑量米非司酮(6.25 mg)與高劑量米非司酮(12.50 mg) 治療子宮內膜異位癥的效果相當，但服用小劑量米非司酮患者發(fā)生惡心、嘔吐、頭暈、皮疹等不良反應者較少[17-18]。陳勇[19]采用不同劑量米非司酮治療腹腔鏡下子宮內膜異位癥患者病灶清除后的患者，結果發(fā)現，小劑量米非司酮組(6.3 mg)患者的癥狀緩解率和復發(fā)率均優(yōu)于大劑量米非司酮組(12.5 mg)，且對患者體內激素水平的影響小于大劑量米非司酮組。楊其偉[20]也探討了不同劑量米非司酮治療子宮內膜異位癥的臨床療效，結果發(fā)現，不同劑量米非司酮對子宮內膜異位癥患者均有較好療效，但低劑量米非司酮對患者內分泌水平影響更小，長期應用不影響患者骨密度。

總之，本研究結果顯示，高劑量米非司酮治療子宮內膜異位癥可取得更好的療效，但其是否會帶來相關不良反應尚需進一步研究。