陶 濤，周 全，周 嘉

(1.湛江中心人民醫(yī)院麻醉科，廣東 湛江 524045；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣東 廣州 510515)

對(duì)乙酰氨基酚 (acetaminophen，APAP) 是一種廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛藥，過量服用會(huì)使肝內(nèi)代謝產(chǎn)物堆積，直接損傷肝細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的急性肝損傷，約48%的急性肝損傷由APAP過量攝入引起[1]。研究顯示，腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)通路激活對(duì)保護(hù)APAP誘導(dǎo)的肝損傷起關(guān)鍵作用[2-3]。ω-3 多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3PUFA)是第1個(gè)不飽和鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端第3位的PUFA，主要包含二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentenoic acid，EPA)[4]。研究顯示，ω-3PUFA在多個(gè)肝臟疾病模型中發(fā)揮保護(hù)作用，且具有活化AMPK通路的功能[5-7]。本研究使用能夠自身合成ω-3PUFA的Fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠，探討 ω-3PUFA 對(duì)APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用及其對(duì)AMPK通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無特定病原體級(jí)健康C57BL/6雌性野生型(wide type，WT)小鼠24只(WT組)由南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，8周齡，體質(zhì)量22～25(23.47±1.01)g；Fat-1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠24只(Fat-1組)由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院周嘉惠贈(zèng)，8周齡，體質(zhì)量 20～25(23.13±1.45)g；2組小鼠飼養(yǎng)8周，飼養(yǎng)溫度(23±2) ℃，自然通風(fēng)，明暗周期 12 h/12 h，自由攝食、飲水。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器HepaRG細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，APAP(美國Santa Cruz公司)，1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transarninase，ALT)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，蛋白裂解液和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(浙江聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。Western blot和凝膠成像設(shè)備(美國Bio-Rad公司)，雙激光流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，組織自動(dòng)脫水機(jī)、恒溫?cái)偪酒瑱C(jī)、石蠟切片機(jī)(德國徠卡公司)，顯微鏡及其拍照系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.3 急性肝損傷小鼠模型制備參照文獻(xiàn)[8]方法制備急性肝損傷小鼠模型。WT組和Fat-1組小鼠均腹腔注射APAP 400 mg·kg-1；分別于腹腔注射后0、2、6、24 h應(yīng)用CO2法每組處死6只小鼠，采集小鼠肝組織和靜脈血，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 小鼠血清ALT水平檢測應(yīng)用ALT檢測試劑盒檢測小鼠血清ALT水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化取腹腔注射后24 h處死小鼠的肝組織，40 g·L-1多聚甲醛固定48 h，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm切片，通過烤片、脫蠟、水化后，蘇木精染色5 min，蒸餾水返藍(lán) 1 min，伊紅染色1 min，然后脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 Western blot法檢測肝組織中AMPK和磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)水平稱取2組小鼠腹腔注射APAP后0、2、6 h獲取的新鮮肝組織100 mg，于蛋白裂解液中充分裂解后離心取上清液，變性制備蛋白樣品；將2組樣品分別等質(zhì)量加樣至泳道，電泳后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯膜，200 mA 冰浴120 min；50 g·L-1牛血清白蛋白室溫封閉60 min后置于水平搖床，加入AMPK、p-AMPK和磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗孵育 45 min；加入發(fā)光液在暗室曝光，經(jīng)顯影、定影后將膠片掃描至電腦，應(yīng)用ImageJ軟件獲取條帶的吸光度值進(jìn)行定量分析。

1.7 Western blot法檢測HepaRG細(xì)胞中AMPK和p-AMPK表達(dá)取HepaRG細(xì)胞，使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于 37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。應(yīng)用20 mmol APAP孵育6 h誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞凋亡，換培養(yǎng)基后將細(xì)胞分為APAP+DHA組和APAP+DMSO組，APAP+DHA組在培養(yǎng)基中加入50 μmol DHA，APAP+DMSO組在培養(yǎng)基中加入DMSO，使其最終體積分?jǐn)?shù)為1‰；繼續(xù)溫箱孵育，分別于處理0、3、6 h時(shí)收集大于1×106個(gè)HepaRG細(xì)胞裂解制備蛋白樣品，采用Western blot法檢測HepaRG細(xì)胞中AMPK和p-AMPK表達(dá)，操作步驟同“1.6”項(xiàng)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測HepaRG細(xì)胞凋亡情況取HepaRG細(xì)胞并隨機(jī)分為PBS+DHA組、PBS+DMSO組、APAP+DHA組和APAP+DMSO組，APAP+DHA組和APAP+DMSO組細(xì)胞加入20 mmol APAP孵育6 h誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞凋亡，PBS+DHA組和PBS+DMSO組細(xì)胞加入PBS，換培養(yǎng)基后，APAP+DHA組和PBS+DHA組在培養(yǎng)基中加入50 μmol DHA，APAP+DMSO組和PBS+DMSO組在培養(yǎng)基中加入DMSO，使其最終體積分?jǐn)?shù)為1‰；各組細(xì)胞繼續(xù)溫箱孵育6 h，收集細(xì)胞，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測HepaRG細(xì)胞凋亡率，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠血清ALT水平比較結(jié)果見表1。腹腔注射APAP后0 h時(shí)2組小鼠血清ALT水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組小鼠腹腔注射APAP后2、6、24 h時(shí)血清ALT水平顯著高于0 h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腹腔注射APAP后2、6、24 h時(shí)，F(xiàn)at-1組小鼠血清ALT水平顯著低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2組小鼠血清ALT水平比較

nALT/(U·L-1)0 h2 h6 h24 hWT665.86±6.19313.30±26.12a943.00±37.67a424.20±14.64aFat-1671.86±2.53247.40±25.25ab431.80±6.10ab244.80± 12.60ab

注：與0 h時(shí)比較aP<0.05；與WT組比較bP<0.05。

2.2 2組小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化結(jié)果見圖1。HE染色結(jié)果顯示，WT組小鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的變性或壞死，細(xì)胞核溶解或固縮，肝細(xì)胞索正常形態(tài)被破壞并伴有明顯的炎性細(xì)胞浸潤；而Fat-1組小鼠肝臟組織病變較輕。

A：WT組；B：Fat-1組。

圖1 2組小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×100)

Fig.1 Morphological changes of liver tissues of mice in the two groups(HE staining，×100)

2.3 2組小鼠肝組織中AMPK及p-AMPK相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖2和表2。腹腔注射APAP后0 h時(shí)2組小鼠肝組織中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腹腔注射APAP后2、6 h時(shí)Fat-1組小鼠肝組織中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量顯著高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。WT組小鼠腹腔注射APAP后2、6 h時(shí)肝組織中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量顯著低于0 h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Fat-1組小鼠腹腔注射APAP后0、2、6 h時(shí)肝組織中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腹腔注射APAP后0、2、6 h時(shí)2組小鼠肝組織中AMPK相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 2組小鼠肝組織中AMPK和p-AMPK表達(dá)(Western blot)

Fig.2 Expression of AMPK and p-AMPK in liver tissues of mice in the two groups (Western blot)

表2 2組小鼠肝組織中AMPK及p-AMPK表達(dá)比較

nAMPK0 h2 h6 hp-AMPK0 h2 h6 hWT61.20±0.141.14±0.061.14±0.060.76±0.070.38±0.06a0.12±0.04aFat-161.18±0.101.18±0.041.16±0.070.72±0.120.88±0.05b0.80±0.12b

注：與0 h時(shí)比較aP<0.05；與WT組比較bP<0.05。

2.4 DHA對(duì)APAP誘導(dǎo)的HepaRG細(xì)胞中AMPK磷酸化的影響結(jié)果見表3和圖3。處理 0 h 時(shí)2組HepaRG細(xì)胞中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；處理3、6 h時(shí)，APAP+DHA組HepaRG細(xì)胞中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量顯著高于APAP+DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。APAP+DHA組和APAP+DMSO組HepaRG細(xì)胞處理3、6 h時(shí)p-AMPK相對(duì)表達(dá)量顯著低于0 h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；APAP+DHA組和APAP+DMSO組HepaRG細(xì)胞處理0、3、6 h時(shí)AMPK相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 2組HepaRG細(xì)胞中AMPK和p-AMPK表達(dá)比較

nAMPK0 h3 h6 hp-AMPK0 h3 h6 hAPAP+DMSO31.94±0.072.03±0.091.96±0.151.05±0.070.31±0.07a0.08±0.03aAPAP+DHA31.97±0.162.06±0.162.03±0.081.02±0.090.56±0.05ab0.27±0.06ab

注：與0 h時(shí)比較aP<0.05；與APAP+DMSO組比較bP<0.05。

圖3 2組HepaRG細(xì)胞中AMPK和p-AMPK表達(dá)(Western blot)

Fig.3 Expression of AMPK and p-AMPK in HepaRG cells of the two groups(Western blot)

2.5 DHA對(duì)APAP誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見表4。APAP+DMSO組、APAP+DHA組HepaRG細(xì)胞凋亡率均顯著高于PBS+DMSO組和PBS+DHA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；APAP+DHA組HepaRG細(xì)胞凋亡率顯著低于APAP+DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PBS+DMSO組與PBS+DHA組HepaRG細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 4組HepaRG細(xì)胞凋亡率比較

n/%PBS+DMSO31.91±0.11PBS+DHA31.89±0.08APAP+DMSO36.91±0.11abAPAP+DHA34.03±0.09abc

注：與PBS+DMSO組比較aP<0.05；與PBS+DHA組比較bP<0.05；與APAP+DMSO組比較bP<0.05。

3 討論

肝臟是藥物代謝的主要場所，藥物性肝損傷是指由于藥物及其代謝產(chǎn)物的毒性損害或過敏反應(yīng)而產(chǎn)生的肝臟損傷[9]。APAP過量攝入是臨床發(fā)生藥物代謝性肝損傷的主要原因，尋找緩解APAP毒性的方法非常重要。ω-3PUFA是第1個(gè)不飽和鍵出現(xiàn)在碳鏈甲基端第3位的PUFA，主要包含DHA和EPA。ω-3PUFA具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎的特性，可以通過增加抗氧化酶的能力從而減少過氧化物酶的產(chǎn)生。研究證明，ω-3PUFA在肝硬化、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防及治療中具有重要作用[10-12]。Fat-1基因的編碼產(chǎn)物是ω-3脂肪酸脫氫酶，其能夠使ω-6PUFA脫氫轉(zhuǎn)化為ω-3PUFA，KANG等[13]以C57BL/6小鼠為背景成功建立了Fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠，F(xiàn)at-1轉(zhuǎn)基因小鼠自身能夠合成ω-3PUFA。因此，本研究采用Fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠和其野生型C57BL/6小鼠作為研究動(dòng)物，利用Western blot、HE染色和流式細(xì)胞術(shù)等方法，探究ω-3PUFA對(duì) APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，小鼠腹腔注射APAP后24 h WT組小鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的變形或壞死，而Fat-1組小鼠肝臟病變較輕；且2組小鼠腹腔注射APAP后2、6、24 h時(shí)血清ALT水平顯著高于0 h時(shí)，同時(shí)Fat-1組小鼠血清ALT水平顯著低于WT組；另外，體外細(xì)胞研究顯示，APAP+DMSO組和APAP+DHA組HepaRG細(xì)胞凋亡率顯著高于 PBS+DMSO組和PBS+DHA組，APAP+DHA組HepaRG細(xì)胞凋亡率顯著低于APAP+DMSO組，PBS+DMSO組與PBS+DHA組HepaRG細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示APAP腹腔注射能夠誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，而ω-3PUFA能夠緩解小鼠由APAP所致的急性肝損傷。

AMPK通路的活化被認(rèn)為在APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，其主要作用機(jī)制為穩(wěn)定肝細(xì)胞的線粒體膜電位、促進(jìn)線粒體融合以維持線粒體功能[14]，抵抗經(jīng)肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素P450家族成員CYP2E1、CYP1A2及CYP3A4代謝APAP產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物堆積導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷[15]。有研究顯示，ω-3PUFA可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中AMPK磷酸化，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，且AMPK通路的活化可以增強(qiáng)胰島素抵抗的作用，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成的急性損傷[16]。還有研究表明，ω-3PUFA能夠減輕LPS所致腦損傷新生大鼠海馬組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少海馬組織細(xì)胞凋亡[17]。因此，作者推測ω-3PUFA對(duì)APAP造成的肝損傷的保護(hù)作用也是通過AMPK信號(hào)通路激活而實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，腹腔注射APAP后2、6 h時(shí)Fat-1組小鼠肝組織中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量顯著高于WT組，WT組小鼠腹腔注射APAP后2、6 h時(shí)肝組織中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量顯著低于0 h時(shí)，而Fat-1組小鼠腹腔注射APAP后0、2、6 h時(shí)肝組織中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外，體外細(xì)胞研究顯示，處理3、6 h時(shí)，APAP+DHA組HepaRG細(xì)胞中p-AMPK相對(duì)表達(dá)量顯著高于APAP+DMSO組；提示ω-3PUFA可能通過促進(jìn)AMPK信號(hào)通路活化而保護(hù)APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷。

綜上所述，ω-3PUFA對(duì)APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與ω-3PUFA促進(jìn)AMPK通路活化有關(guān)。ω-3PUFA的主要成分DHA有可能作為臨床營養(yǎng)劑而用于APAP誘導(dǎo)肝損傷的防治。