夏天光，刁云鋒，畢 瑩，張 健，陳江龍，董化江，董月青

(武警后勤學院附屬醫(yī)院腦創(chuàng)傷與神經疾病研究所，天津 300162)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種能導致認知能力嚴重下降的神經退行性疾病[1]，其主要表現為漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經精神癥狀。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是導致AD的關鍵因素，常以單體、可溶性或不溶性寡聚體及不溶性淀粉樣纖維等形式存在，其聚集體具有明顯的神經毒性，可在AD患者大腦神經細胞間形成老年斑，誘發(fā)神經元變性與凋亡。糖化β-淀粉樣蛋白(glycated β-amyloid protein，Aβ-AGE)是一種高級糖化終產物(advanced glycation endproducts，AGEs)，其是以Aβ為底物的蛋白質氨基與還原糖及其衍生物的羰基在無酶條件下發(fā)生一系列糖化反應而產生的一種不溶于水、不被降解的交聯(lián)體。AGEs通過AGEs受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)與神經元發(fā)生作用，可誘導神經元的氧化應激，促使相關細胞因子和Aβ的釋放。Aβ是RAGE的一種配體，RAGE可促進Aβ生成，在Aβ介導的神經細胞毒性中起重要作用[5]。研究顯示，Aβ-AGE可進一步促進Aβ聚積，且有更強的神經細胞毒性，在AD發(fā)病過程中的致病性強于Aβ[2-3]。本課題組既往研究表明，Aβ在體內外均能形成Aβ-AGE，且在體外Aβ-AGE會加劇Aβ誘導的神經細胞毒性[4]，但在體實驗中，Aβ-AGE對AD樣大鼠行為學改變及其作用機制尚不清楚。本研究旨在觀察Aβ-AGE對AD樣大鼠認知功能的影響，并探討RAGE介導的信號轉導通路在Aβ-AGE對AD樣大鼠認知功能影響中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康無特定病原體級成年Sprague Dawley雄性大鼠40只，體質量 280～320 g，由解放軍軍事醫(yī)學科學院提供,動物許可證號：0047126。

1.2 主要試劑與儀器小鼠單克隆RAGE抗體(receptor for advanced glycation endproducts mouse monoclonal antibody,Anti-RAGE)、小鼠單克隆β-肌動蛋白抗體(beta-actin mouse monoclonal antibody，Anti-β-actin)(美國Millipore公司),人β-淀粉樣蛋白1-42(amyloid β1-42，Aβ1-42)、甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)(美國Sigma公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗(美國Pierce公司)，聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、電化學發(fā)光(electro-chemi-luminescence，ECL)液(上海碧云天生物技術研究所)，二氨基聯(lián)苯胺 (diaminobenzidine，DAB) 顯色試劑盒、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(中國北京索萊寶科技有限公司)；DMS-2型Morris水迷宮測試系統(tǒng)(海欣曼科教設備有限公司)。

1.3 Aβ-AGE的制備無菌條件下取1 g·L-1的Aβ1-420.5 mL置于EP管中，加入0.5 mmol·L-1的MG緩沖液0.5 mL，在37 ℃孵育箱溫育1個月，將混合液移入透析袋，扎緊透析袋并置入 1 mL 的 0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)中，于 4 ℃冰箱內進行轉動透析,持續(xù)48 h，每 4 h 更換1次 PBS，除去MG，成功制備Aβ-AGE。將透析完畢的Aβ-AGE混合液于超凈臺濾過除菌，EP管分裝，密封，-20 ℃儲存。

1.4 動物分組與模型制備將40只大鼠隨機分為Aβ組、Aβ+Anti-RAGE組、Aβ-AGE組、Aβ-AGE+Anti-RAGE組，每組10只。根據CHEN等[6]文獻方法制備大鼠AD樣模型。各組大鼠按 6 mL·kg-1的劑量給予60 g·L-1水合氯醛腹腔內注射麻醉，將大鼠固定于立體定向儀器上，選取前囟后1.0 mm、中線旁開1.5 mm、深度3.8 mm的位置，行左側側腦室注射，將相應的試劑溶于0.01 mL 30 g·L-1的BSA中，1次性注入左側側腦室，其中Aβ組大鼠給予Aβ 5 μg，Aβ+Anti-RAGE組大鼠給予Aβ 5 μg和RAGE抗體 Anti-RAGE 50 μg，Aβ-AGE組大鼠給予Aβ-AGE 5 μg，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠給予Aβ-AGE 5 μg 和Anti-RAGE 50 μg。

1.5 各組大鼠空間學習記憶能力檢測采用Morris水迷宮實驗觀察各組大鼠空間學習記憶能力，包括潛伏期(即大鼠從入水至找到平臺所用的時間)、目標象限停留時間和穿越平臺次數等。在立體定向注射后第2～7 天，每只大鼠每天在第III象限訓練 1 次，每次游泳的時間限為 60 s，大鼠爬上平臺后，讓其在平臺上停留10 s；如在60 s內未找到平臺者，系統(tǒng)自動停止記錄，潛伏期記為 60 s，由測試者引導大鼠至平臺，使其休息30 s；連續(xù)訓練6 d，每日進行4次，記錄大鼠尋找隱匿平臺的潛伏期。立體定向注射后第9天移去水下平臺，讓大鼠自由游泳60 s尋找平臺，記錄大鼠在目標象限停留時間和穿越平臺次數(即穿越平臺所在區(qū)域的次數)。

1.6 Western blot法檢測各組大鼠海馬組織中RAGE的表達注射后第9天，水迷宮實驗結束后，每組取5只大鼠斷頭取腦，冰上分離海馬組織，取適量海馬組織放入預冷裂解液(裂解液成分：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽0.010 mol·L-1，氟化鈉 0.050 mol·L-1，正釩酸鈉0.001 mol·L-1，乙二胺四乙酸0.001 mol·L-1，甲脒0.001 mol·L-1，苯基甲基磺酰氟0.001 mol·L-1，0.001 mol·L-1絲氨酸蛋白酶抑制劑，基礎溶劑為雙蒸水)中，加入研磨珠，用組織研磨儀研磨60 s，冰上裂解 30 min，4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清液，加入聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液制備大鼠腦組織蛋白樣本。根據BCA蛋白定量試劑盒說明書檢測樣品中蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳：80 V電泳 30 min，之后120 V電泳50 min，300 mA 轉膜 90 min，Tris-HCl 緩沖鹽溶液洗膜 2 min，體積分數 50 g·L-1BCA封閉，室溫搖床 1 h，Tris-HCl 緩沖鹽溶液洗膜 3 次，每次8 min，分別加入一抗RAGE和Anti-β-actin進行孵育，其中RAGE和Anti-β-actin稀釋比例為 11 000，4 ℃過夜，次日洗膜3次，37 ℃ 辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗(15 000)孵育1 h，洗膜3次，采用ECL液進行顯色，膠片曝光，定影，顯影，使用Quantity One軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，灰度值高則表明蛋白表達量多。

1.7 免疫組織化學染色法檢測各組大鼠大腦皮層中RAGE蛋白表達注射后第9天，水迷宮實驗結束后，每組取5只大鼠，按6 mL·kg-1的劑量給予60 g·L-1水合氯醛腹腔內注射麻醉，經心臟先灌注100 mL生理鹽水，然后灌注40 g·L-1的多聚甲醛溶液400 mL，取大鼠大腦組織置于 40 g·L-1的多聚甲醛溶液20 mL中固定24 h。采用震蕩切片機行大腦組織連續(xù)切片，制備海馬組織的冠狀切片，厚度為20 μm。每只大鼠選取3～5個連續(xù)切片，采用RAGE抗體進行免疫組織化學染色：取固定好的大腦震蕩切片用 0.01 mmol·L-1的PBS震洗3次，每次5 min；然后滴加體積分數3 g·L-1的H2O2緩沖溶液以消除內源性過氧化物酶，室溫放置15 min，用 0.01 mmol·L-1的PBS震洗3次，每次 5 min；加入50 g·L-1BSA封閉60 min；加入一抗RAGE(11 000)4 ℃過夜；次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗37 ℃ 孵育1 h，并用DAB顯色 2 min，中性樹膠封片，隨機選取2組大鼠大腦皮層切片各3張，置于倒置顯微鏡下，每張切片計數5個視野，采用IPP 6.0軟件計算大鼠大腦皮層RAGE陽性表達細胞數，細胞核呈現棕黃色細顆粒狀物質沉積則為RAGE表達陽性。

2 結果

2.1 4組大鼠潛伏期比較結果見表1。在注射后第2天，各組大鼠潛伏期比較差異無統(tǒng)計學意義(F=3.767，P>0.05)。注射后第3～7天，各組大鼠潛伏期比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=9.167、25.050、56.980、62.380、122.200，P<0.05)；Aβ-AGE組大鼠潛伏期顯著長于Aβ組，Aβ+Anti-RAGE組大鼠潛伏期顯著短于Aβ組，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠潛伏期顯著短于Aβ-AGE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 4組大鼠潛伏期比較

n/s234567Aβ1059.96±1.0549.37±1.6832.10±3.0533.13±3.5020.80±2.719.73±1.62Aβ-AGE1060.07±1.2157.83±3.25a42.27±1.10a42.53±4.42a34.57±1.40ba29.77±2.66aAβ+Anti-RAGE1059.00±1.7344.67±2.52a23.00±3.46a22.30±2.52a14.32±3.05a5.34±2.31aAβ-AGE+Anti-RAGE1060.07±1.9351.77±1.86b36.83±2.25b33.30±1.26b26.03±1.65b17.57±1.69bF3.7679.16725.05056.98062.380122.200P0.0600.0100.0000.0000.0000.000

注：與Aβ組比較aP< 0.05；與Aβ-AGE組比較bP<0.05。

2.2 4組大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間比較結果見表2。在立體定向注射后第9天，各組大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=12.930、13.560，P<0.05)。Aβ-AGE組大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間顯著小于Aβ組，Aβ+Anti-RAGE組大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間顯著大于Aβ組，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間顯著大于Aβ-AGE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 4組大鼠穿越平臺次數、目標象限停留時間比較

n/sAβ103.60±0.4629.33±2.52Aβ-AGE101.99±0.11a19.17±0.76aAβ+Anti-RAGE104.23±0.71a31.67±3.06aAβ-AGE+Anti-RAGE103.23±0.25b26.83±2.25bF12.93013.560P0.0000.000

注：與Aβ組比較aP< 0.05；與Aβ-AGE組比較bP< 0.05。

2.3 4組大鼠海馬組織中RAGE蛋白表達比較結果見圖1和圖2。注射后第9天，Aβ組、Aβ+Anti-RAGE組、Aβ-AGE組、Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對表達量分別為0.56±0.03、0.47±0.08、0.77±0.11、0.48±0.07，各組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=8.626，P<0.05)；其中Aβ-AGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對表達量顯著高于Aβ組(P<0.05)，Aβ+Anti-RAGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對表達量與Aβ組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對表達量顯著低于Aβ-AGE組(P<0.05)。免疫組織化學染色結果顯示，Aβ組、Aβ+Anti-RAGE組、Aβ-AGE組、Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽性細胞數分別為(25.10±0.15)、(17.23±2.25)、(38.17±2.16)、(23.16±1.20)個·cm-2，各組大鼠大腦皮層中RAGE陽性細胞數比較差異有統(tǒng)計學意義(F=76.370，P<0.01)；Aβ-AGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽性細胞數顯著高于Aβ組(P<0.01)，Aβ+Anti-RAGE組大鼠皮層中RAGE陽性細胞數顯著低于Aβ組(P<0.01)；Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠皮層中RAGE陽性細胞數顯著低于Aβ-AGE組(P<0.01)。

A：Aβ組；B：Aβ-AGE組；C：Aβ+Anti-RAGE組；D：Aβ-AGE+Anti-RAGE組。

圖1 各組大鼠海馬組織中RAGE表達(Western blot)

Fig.1 Expression of RAGE in hippocampus of rats in each group (Western blot)

A：Aβ組；B：Aβ-AGE組；C：Aβ+Anti-RAGE組；D：Aβ-AGE+Anti-RAGE組。

圖2 各組大鼠大腦皮層中RAGE陽性表達情況(免疫組織化學染色，×400)

Fig.2 Positive expression of RAGE in the cerebral cortex of rats in each group(immunohistochemical staining,×400)

3 討論

AD是一種以進行性認知功能障礙為主要臨床表現的神經退行性病變，其主要病理學特征是位于細胞內的神經纖維纏結和位于細胞外的老年斑。前者主要由過度磷酸化的tau蛋白聚積而成，后者的主要成分是Aβ[7]。大腦中葡萄糖代謝嚴重紊亂與AD的發(fā)展密切相關[8-9]，其會導致體內大量AGEs的形成和積聚，而AGEs已被證明與AD的發(fā)生密切相關[10-11]。AGEs的產生是一種涉及細胞內外環(huán)境的復雜的非酶促階梯式反應過程[10]。在葡萄糖代謝和氧化應激過程中，AGEs的水平會顯著提高，AGEs會導致許多活性羰基化合物的形成，而這些羰基化合物又可與蛋白質反應形成AGEs。AD患者或動物模型體內的AGEs水平明顯升高。體外研究顯示，AGEs修飾增加淀粉樣蛋白的錯誤折疊[2]。在體研究表明，AGEs與AD病理性蛋白Aβ是共定位的[12]。以上研究提示，AGE修飾的蛋白質可能與AD的病理和發(fā)病機制有關。本課題組以往研究表明，Aβ-AGE可加重Aβ介導的體外培養(yǎng)海馬神經元的神經毒性[13]，但其作用和潛在的體內機制仍有待進一步研究。為驗證Aβ-AGE對AD樣大鼠認知功能的影響，本研究將Aβ-AGE注入大鼠側腦室，通過Morris水迷宮實驗檢測發(fā)現，與Aβ組相比，Aβ-AGE能顯著延長大鼠尋找隱匿平臺的潛伏期，減少穿越平臺次數和目標象限停留時間，表明Aβ-AGE可加重AD樣大鼠認知功能障礙。

RAGE是免疫球蛋白家族中的一個多配體受體，可與AGEs和Aβ結合。研究表明，RAGE在Aβ介導的細胞功能紊亂中起重要作用[14]。當Aβ在AD患者腦中累積時，RAGE表達水平增加，這種機制可能加重RAGE與配體相互作用所引起的細胞功能障礙[15]。之前本課題組觀察到RAGE參與了Aβ-AGE對體外培養(yǎng)的神經元的損傷作用[13],但尚不清楚RAGE是否參與在體實驗中Aβ-AGE誘導的AD樣認知功能障礙。本研究通過觀察RAGE是否參與Aβ-AGE對AD樣大鼠認知功能的影響，Western blot結果發(fā)現，Aβ-AGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白表達水平與Aβ組比較明顯增高，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠海馬組織中RAGE蛋白相對表達量顯著低于Aβ-AGE組。免疫組織化學染色結果同樣顯示，Aβ-AGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽性細胞數顯著高于Aβ組，Aβ+Anti-RAGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽性細胞數顯著低于Aβ組；Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠大腦皮層中RAGE陽性細胞數顯著低于Aβ-AGE組，提示RAGE參與了Aβ-AGE誘導的認知功能障礙這一過程。

細胞內的AGEs可能是直接通過交聯(lián)作用對蛋白產生影響，而細胞外的AGEs可能是通過與其受體相結合將信號傳入細胞內而影響細胞內蛋白表達。有證據表明，RAGE表達的增加可使其誘導更為嚴重的細胞功能紊亂[16]。為了探討RAGE介導的通路是否與Aβ-AGE的作用相關，本研究使用RAGE抗體阻斷RAGE信號轉導通路，結果觀察到立體定向注射后第3～7天，Aβ+Anti-RAGE組大鼠尋找隱匿平臺的潛伏期顯著短于Aβ組，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠尋找隱匿平臺的潛伏期同樣顯著短于Aβ-AGE組；在立體定向注射后第9天，Aβ+Anti-RAGE組大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間顯著長于Aβ組，Aβ-AGE+Anti-RAGE組大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間同樣顯著大于Aβ-AGE組；以上結果提示，給予RAGE抗體阻斷后，可以有效減輕大鼠空間記憶功能損傷，由此提示Aβ-AGE誘導的AD樣認知功能障礙可能是通過干預RAGE信號轉導通路而產生的。

綜上所述，Aβ-AGE可加重AD樣大鼠的認知功能障礙，并增加AD樣大鼠腦組織RAGE的表達，而RAGE抗體能有效減輕由Aβ-AGE誘導的認知功能障礙。本研究進一步證實了Aβ-AGE可加重大鼠的神經損害，其機制可能是通過激活RAGE信號轉導通路介導加重AD樣大鼠的認知功能障礙，Aβ-AGE和RAGE可能成為新的AD治療靶點。