張文杰,李曉芳,張紅偉,樊 騰,徐璐丹,楊明月,胡淋淋,秦鵬宇,岳修勤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科,河南 衛(wèi)輝 453100)

開胸手術(shù)后肺損傷一般指各種胸部外科手術(shù)后以非心源性肺水腫和持續(xù)低氧血癥為癥狀的臨床綜合征。胸段硬膜外阻滯(thoracic epidural block，TEB)可有效阻滯相應(yīng)階段的交感神經(jīng)，降低交感神經(jīng)張力，擴(kuò)張相應(yīng)階段的小動脈，從而改善阻滯區(qū)域的血流和微循環(huán)，降低胸部外科手術(shù)后患者心肺并發(fā)癥發(fā)生率及病死率[1]。但是，TEB對缺氧性肺損傷炎性因子的影響目前研究較少。本研究擬建立大鼠急性缺氧性肺損傷模型，觀察TEB對急性缺氧性肺損傷大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)等炎性因子水平的影響，進(jìn)一步探究TEB的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物選取45只健康雄性清潔級Wistar 大鼠(北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司)，鼠齡80～100 d，體質(zhì)量(350±20)g；在統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔級恒溫(25 ℃)環(huán)境下飼養(yǎng)1周，自由飲水,實(shí)驗前12 h 禁食。整個實(shí)驗過程均嚴(yán)格按照動物倫理學(xué)要求處置實(shí)驗動物。

1.2 主要試劑與儀器含體積分?jǐn)?shù)14%氧的氮氧混合壓縮空氣、含體積分?jǐn)?shù)21%氧的氮氧混合壓縮空氣(新鄉(xiāng)市北普特種氣體有限公司)，大鼠TNF-α、IL-6、 IL-10檢測試劑盒(上海越研生物科技有限公司)；RGZ-120型體質(zhì)量計(河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)股份有限公司)，多功能生物信息采集系統(tǒng)、ALC-V8小動物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，多功能臺式高速冷凍離心機(jī)、全波長掃描酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific 公司)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.3 動物分組及實(shí)驗方法將45只大鼠隨機(jī)分為對照組、缺氧組和TEB組，每組15只。各組大鼠腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(300 mg·kg-1)進(jìn)行麻醉，行胸段硬膜外腔置管并留管，TEB組大鼠經(jīng)胸段硬膜外腔給予5 g·L-1羅哌卡因0.125 mL·kg-1[2],通過皮溫變化(0.5～1.0 ℃)間接判斷TEB是否成功[3]；對照組與缺氧組大鼠經(jīng)胸段硬膜外腔給予等量的生理鹽水。TEB模型制備成功10 min后，各組大鼠行頸動脈置管術(shù)并氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，缺氧組與TEB組大鼠吸入含體積分?jǐn)?shù)14%氧的氮氧混合氣體，連續(xù)監(jiān)測大鼠的生命體征及通氣參數(shù)，并每隔 5 min (T5 min、T10 min、T15 min)抽取頸動脈血0.3～0.5 mL，測動脈血?dú)?，直至動脈血氧合指數(shù)<300為急性缺氧性肺損傷模型建立成功；對照組大鼠持續(xù)吸入含體積分?jǐn)?shù)21%氧的氮氧混合氣體。建立急性缺氧性肺損傷模型期間，TEB組大鼠每2 h追加5 g·L-1羅哌卡因0.125 mL·kg-1,對照組與缺氧組大鼠追加相同劑量生理鹽水，共追加2次。于氣管插管前(T0)、急性缺氧性肺損傷模型建立成功后4 h(T1)進(jìn)行各組大鼠動脈血?dú)夥治觥?/p>

1.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平檢測于氣管插管前(T0)、急性缺氧性肺損傷模型建立成功后4 h(T1)時，經(jīng)右側(cè)頸總動脈采血0.5 mL,4 ℃ 5 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，-20 ℃ 冰箱過夜后置于-70 ℃冰箱內(nèi)保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平檢測急性缺氧性肺損傷模型建立成功后4 h(T1)，取血后處死大鼠。大鼠處死后沿腹正中線向上做切口至胸腔，在右主支氣管上端剪下大鼠右肺，將16G套管針緩緩插入右主支氣管后用絲線固定，接5 mL注射器，吸取4 ℃無菌生理鹽水2 mL，緩慢注入肺內(nèi)，停留10 s后緩慢回抽，然后再緩慢注入肺內(nèi)，連續(xù)操作3次，將回抽液置于10 mL滅菌離心管內(nèi)；重復(fù)上述灌洗操作3 次，共收集4～5 mL灌洗液。將灌洗液經(jīng)單層紗布過濾后4 ℃ 3 000 r·min-1離心10 min，取上清液。經(jīng)-20 ℃冰箱過夜后置于-70 ℃冰箱內(nèi)保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠BALF中TNF-α、IL-6和IL-10水平[4-5]，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠造模情況實(shí)驗過程中因液體負(fù)荷過大死亡4只大鼠，其中對照組2只，缺氧組1只，TEB組1只；反復(fù)插管死亡3只，每組1只；TEB過程中死亡3只，每組1只；采血過程中死亡3只，每組1只；缺氧組大鼠因麻醉死亡1只；TEB組大鼠胸段硬膜外腔注藥死亡1只。最終每組10只大鼠納入研究。

2.2 3組大鼠急性缺氧性肺損傷造模前后動脈血氧合指數(shù)比較結(jié)果見表1。對照組、缺氧組、TEB組大鼠T0時動脈血氧合指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著時間的延長，缺氧組和TEB組大鼠T0、T5 min、T10 min、T15 min、T1時動脈血氧合指數(shù)逐漸降低，缺氧組和TEB組大鼠T1時動脈血氧合指數(shù)低于T0時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。缺氧組和TEB組大鼠T1時動脈血氧合指數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TEB組大鼠T1時動脈血氧合指數(shù)高于缺氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組大鼠不同時間點(diǎn)動脈血氧合指數(shù)比較

nT0T5 minT10 minT15 minT110552.9±82.9529.1±89.1500.5±69.6486.2±50.9463.8±41.910550.5±77.6468.6±55.7358.6±45.7254.3±31.4219.3±28.6abTEB10547.1±75.7500.7±49.3386.4±42.1286.4±27.9251.4±15.0abc

注：與T0比較aP<0.05;與對照組比較bP<0.05；與缺氧組比較cP<0.05。

2.3 3組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較結(jié)果見表2。對照組、缺氧組、TEB組大鼠T0時血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，T1時血清TNF -α、IL-6、IL-10水平高于T0時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。缺氧組和TEB組大鼠T1時血清TNF-α、IL-6和IL-10水平高于與對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TEB組大鼠T1時血清TNF-α、IL-6和IL-10水平低于缺氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組大鼠不同時間點(diǎn)血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較

nTNF-α/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)IL-10/(ng·L-1)10 T058.67±3.3250.97±2.5023.39±1.61 T168.37±4.13a61.60±2.67a35.44±1.94a10 T058.62±3.4051.29±2.9327.66±1.77 T1147.78±4.94ab137.72±3.95ab73.01±1.86abTEB10 T058.81±3.6051.13±3.2227.49±1.78 T1114.76±4.18abc107.62±2.58abc53.94±1.78abc

注：與T0時比較aP<0.05；與對照組比較bP<0.05；與缺氧組比較cP<0.05。

2.4 3組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平比較結(jié)果見表3。缺氧組和TEB組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TEB組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平低于缺氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 3組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平比較

nTNF-α/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)IL-10/(ng·L-1)1055.71±4.0538.64±4.1522.82±1.3810139.67±3.78a141.62±3.06a64.69±2.67aTEB10109.18±4.40ab98.50±1.84ab48.55±2.81ab

注：與對照組比較aP<0.05；與缺氧組比較bP<0.05。

3 討論

單肺通氣是一種非生理性通氣模式，在開胸手術(shù)過程當(dāng)中可通過多種病理生理過程誘發(fā)局部甚至全身的應(yīng)激反應(yīng)。開胸手術(shù)過程中因單肺通氣引起低氧血癥的發(fā)生率高達(dá)9%～27%，相關(guān)動物實(shí)驗也表明，單肺通氣超過 30 min氧合指數(shù)會低于300[6]，這主要是因為單肺通氣會造成通氣/血流比例失衡，肺內(nèi)分流量增加，造成機(jī)體氧合降低，因此，單肺通氣比雙肺通氣更容易造成術(shù)后急性肺損傷。近年來，隨著胸外科大手術(shù)的日益增多和對肺保護(hù)策略研究的深入，缺氧性肺損傷越來越受到重視。除單肺通氣造成機(jī)體缺氧外，嚴(yán)重感染、多發(fā)性創(chuàng)傷、休克和中毒等因素也常常引起急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，甚至導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory dis-tress syndrome，ARDS)，進(jìn)而發(fā)展為多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，如果救治不及時往往導(dǎo)致死亡。ALI頑固性低氧血癥的主要原因是因為在多種炎性遞質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞共同參與下造成肺泡上皮和血管內(nèi)皮被廣泛破壞，導(dǎo)致彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷，肺泡及肺間質(zhì)水腫，通氣/血流比例嚴(yán)重失調(diào)[7]。在ALI/ARDS炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展過程中，IL-6和TNF-α是最主要的促炎性細(xì)胞因子，而IL-10是最主要的抗炎性細(xì)胞因子，當(dāng)促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子失去平衡，會促使ALI向ARDS發(fā)展，甚至進(jìn)展為MODS，直至死亡[8]。目前對ALI/ARDS尚缺乏有效的治療方法，病死率仍居高不下。因此，如何有效抑制手術(shù)或麻醉刺激引起的炎性因子釋放，減弱或中斷呈級聯(lián)放大的瀑布樣炎癥反應(yīng)，控制ALI的進(jìn)一步發(fā)展，減少ARDS的發(fā)生，進(jìn)而降低患者的病死率，改善預(yù)后，減少術(shù)后康復(fù)所需時間，已經(jīng)成為臨床工作中迫切需要解決的問題。

通過TEB神經(jīng)阻滯的麻醉方法，可降低麻醉藥物的濃度，能夠使其主要阻滯交感神經(jīng)，而對感覺和運(yùn)動神經(jīng)影響較小[9]。TEB阻滯范圍為T1～T5，阻滯了交感神經(jīng)通路，減少了去甲腎上腺素的釋放，使血漿去甲腎上腺素水平減低，交感神經(jīng)張力降低，血管平滑肌舒張，可減輕缺氧引起的肺血管收縮，增加肺組織的血流供應(yīng)，與此同時還能擴(kuò)張支氣管，改善通氣/血流比例和氧合狀態(tài)，緩解機(jī)體缺氧，改善機(jī)體呼吸功能[10]。本研究結(jié)果顯示，TEB組大鼠T1時動脈血氧合指數(shù)高于缺氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。推測TEB可減輕缺氧所致肺血管和支氣管收縮，改善機(jī)體的呼吸功能。

TEB能夠有效阻斷胸段交感神經(jīng)，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)，使血管緊張素Ⅱ水平下降，減少對機(jī)體神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)的刺激[11]。本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠T1時血清TNF-α、IL-6和IL-10水平高于T0時，說明即使機(jī)體不缺氧，麻醉、手術(shù)、機(jī)械通氣也會成為一種傷害性刺激引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[12]；缺氧組大鼠T1時血清TNF-α、IL-6、IL-10水平高于對照組，說明缺氧刺激引發(fā)了全身炎癥反應(yīng)；本研究結(jié)果顯示，TEB組大鼠T1時血清和BALF中TNF-α、IL-6、IL-10水平高于對照組，但低于缺氧組，說明TEB具有較強(qiáng)的抗炎作用[13]，TEB在減輕全身與肺組織炎癥反應(yīng)的同時，還能糾正促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)失衡，減輕全身炎癥反應(yīng)，對機(jī)體具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，TEB可減少急性缺氧性肺損傷大鼠炎性細(xì)胞因子的釋放，糾正炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)失衡，對機(jī)體有一定的保護(hù)作用。