張國芮，獨軍政，高閃電，田占成，Darien Kheder Ali Mohamed，康 棣，郭艷妮，薛慧文，殷 宏,3

（1.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州730046；2.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州730070；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

藍舌病是由藍舌病毒（Bluetongue virus，BTV）感染羊、牛、鹿等反芻動物引起的一種烈性傳染病，通過媒介昆蟲庫蠓（Culicoides）叮咬進行傳播，是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定必須上報的動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病[1-2]。BTV血清型眾多，已發(fā)現有27個血清型，不同血清型之間不能交叉免疫[3]。目前，藍舌病分布于全球大多數熱帶地區(qū)，并散發(fā)于亞熱帶和溫帶地區(qū)，已成為世界性的傳染病。我國自1979年首次在云南省師宗縣發(fā)現藍舌病以來，已經鑒定出了BTV-1、2、3、4、5、7、9、12、15、16和24等11個血清型，其中1型和16型是主要的致病血清型[4-5]。

BTV是呼腸孤病毒科（Reoviridae）、環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）的代表性成員，是迄今發(fā)現的分子量最大的RNA病毒。BTV基因組由10個分節(jié)段的線性雙鏈RNA（dsRNA）組成（S1～S10），長約19.2 kb，編碼7種結構蛋白（VP1～VP7）和4種非結構蛋白（NS1、NS2、NS3/NS3A和NS4）[1,6-7]。BTV具有雙層衣殼，外層衣殼由60個VP2三聚體（111 kDa）和120個VP5（59 kDa）的三聚體組成，約占病毒總蛋白的40%；核衣殼由VP3、VP7、VP1（RNA聚合酶）、VP4（加帽酶）、VP6（解螺旋酶）構成[8-9]。

BTV的4種非結構蛋白主要負責病毒在細胞中的復制、裝配和釋放等過程。NS1和NS2蛋白是BTV中分子量較大的兩個非結構蛋白，在BTV感染細胞中具有高水平的表達[1]。NS3/NS3A蛋白是BTV編碼的唯一跨膜糖蛋白，可使細胞膜的通透性增加，促進病毒粒子的釋放[10]。NS4蛋白是近來才發(fā)現的，具有拮抗宿主抗病毒反應的功能[6]。NS2蛋白由S8基因編碼，含有357個氨基酸，是病毒包涵體（virus inclusion body，VIB）的主要成分[7]。為了進一步研究NS2蛋白在BTV感染過程中的作用機制，本研究成功表達并純化了NS2蛋白，制備了相應的多克隆抗體。該抗體可與BTV感染細胞中的NS2蛋白發(fā)生特異性反應，為深入研究NS2的生物學功能奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 基因、載體、菌株和動物 藍舌病毒16型標準株RSAvvvv的S8基因（GenBank登錄號：KP821717）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆至pUC-18載體，命名為pUC-NS2；BTV-1型病毒株、表達載體pProEx-HTb、大腸桿菌BL21和DH5α菌株、白紋伊蚊C6/36細胞均由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存；新西蘭大白兔由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 限制性內切酶（BamH I和XhoI）、DL2000 DNA Marker、Premix ExTaqDNA 聚合酶、T4 DNA連接酶、IPTG、Agarose Gel DNA回收試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；胎牛血清購自Gibco公司；質?？焖偬崛≡噭┖蠩.Z.N.A Plasmid DNA Mini Kit購自OMGEA公司；堿性磷酸酶標記山羊抗兔lgG、堿性磷酸酶標記山羊抗小鼠lgG均購自Bioworld公司；小鼠抗6×His標簽單克隆抗體購于北京中杉金橋技術有限公司；Alex 568標記山羊抗兔lgG抗體購自Abcam公司；complete His-Tag Purification Resin購自Roche公司；BCIP/NBT顯色液購自Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.3 PCR引物 根據藍舌病毒標準株RSAvvvv的S8基因序列，設計并合成了一對表達引物，分別在上、下游引物引入BamH I和XhoI酶切位點。上游引物NS2-F序列：5'-GTGGGATCCATGGAGCAAAA GCAACGTAAAT -3'（下劃線處為BamH I酶切位點），下游引物NS2-R序列：5'-CGACTCGAGCT AAACGCCGACCGGCAATATG -3'（下劃線處為XhoI酶切位點），委托南京金斯瑞生物工程有限公司合成。

1.4 重組表達質粒的構建 PCR反應體系（50 μL）：2×Premix ExTaqDNA 25 μL，pUC-NS2模板1 μL，上、下游引物（NS2-F、NS2-R）各1 μL，RNase-Free H2O 22 μL；反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，純化回收的PCR產物經BamH I和XhoI雙酶切后，與同樣雙酶切處理的線性化載體pProEx-HTb進行連接，T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落，接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)后提取質粒。用引物NS2-F/NS2-R進行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的質粒命名為pPro-NS2，委托南京金斯瑞生物工程有限公司測序。

1.5 重組菌的誘導表達 將測序正確的質粒pPro-NS2轉化BL21感受態(tài)細胞，涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，16 h后挑取單菌落接種到5～10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過夜。次日以1∶100比例接種LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，當OD600達到0.8時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導表達，分別在誘導后1、2、3、4、5、6 h內每小時收取1 mL菌液，離心收集菌體，加入75 μL PBS和25 μL 4×上樣緩沖液，沸水浴10 min后進行SDS-PAGE檢測。同時對表達樣品和對照樣品進行Western blot分析，一抗為鼠抗6×His標簽的單抗，二抗為堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠lgG，BCIP/NBT顯色觀察目的蛋白的大小。

1.6 rNS2蛋白的純化 將pPro-NS2重組表達菌接種至1 L含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當OD600達到0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37℃誘導6 h，8000 ×g離心10 min收獲菌體沉淀，經超聲破碎處理后，離心收集沉淀和上清，上清和沉淀分別制樣并進行SDS-PAGE檢測。收集含有目的蛋白的樣品，加入變性裂解緩沖液（pH 7.8，8 mol/L尿素、20 mmol/L磷酸氫鈉、500 mmol/L 氯化鈉）重懸沉淀，超聲裂解10 min，按照Complete His-Tag Purification Resin蛋白質純化說明方法進行純化，并對產物進行SDS-PAGE鑒定。

1.7 NS2抗體制備 將純化的NS2蛋白與完全弗氏佐劑等體積混合充分乳化，于新西蘭兔背部皮下多點注射進行免疫，200 μg/只。首免后20、30 d用相同劑量與等量弗氏不完全佐劑乳化后加強免疫2次，三免后10 d從心臟采血，分離血清-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 NS2抗體特異性的鑒定 對IPTG誘導表達6 h的NS2重組菌及純化的NS2蛋白進行SDS-PAGE。同時，離心收集BTV-1感染后12、36 h的及未感染的C6/36細胞，加入上樣緩沖液，沸水浴10 min后進行SDS-PAGE；然后轉印PVDF膜進行Western blot，以制備的兔抗NS2蛋白抗體為一抗，堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG為二抗，BCIP/NBT顯色觀察制備抗體與重組NS蛋白及天然NS2蛋白的免疫反應。

1.9 間接免疫熒光分析（indirect immunofluorescence assay，IFA） 病毒接種于帶爬片的12孔板中，感染C6/36細胞，同時設未感染細胞對照；于28℃分別培養(yǎng)24 h和48 h時吸棄培養(yǎng)基，經PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛室溫固定，0.5%的Triton X-100透化，3%BSA封閉；于4℃孵育抗NS2蛋白抗體12 h，然后用Alexa Fluor 568標記的山羊抗兔IgG避光孵育1 h；用Hoechst 33342對細胞核染色，PBS洗滌3次封片后，用熒光顯微鏡觀察并采集圖像[11]。

2 結果

2.1 重組表達載體pPro-NS2的構建與鑒定 以含有NS2基因的pUC-NS2質粒為模板，NS2-F/NS2-R為表達引物進行PCR擴增。電泳結果顯示，NS2基因片段的大小約為1065 bp，與預期大小相符（圖1）。對PCR產物進行純化回收后，用限制性內切酶BamH I和XhoI雙酶切，與經同樣雙酶切處理的pProEx-HTb表達載體進行連接，構建獲得了重組表達質粒pPro-NS2。測序結果顯示，該重組質粒含有的S8基因序列與參考序列完全一致，且含有正確的開放閱讀框，表明原核表達質粒pPro-NS2構建成功。

2.2 pPro-NS2重組菌的誘導表達 將重組質粒pPro-NS2轉化BL21感受態(tài)細胞，當OD600達到0.8時加入IPTG進行誘導，誘導后1、2、3、4、5、6 h時收取樣品。SDS-PAGE結果表明，與未誘導對照相比，誘導表達樣品均出現特異的蛋白條帶（約48 kDa），與預期大小一致，且表達量在誘導6 h達到最大（圖2）。取誘導6 h的重組菌樣品進行Western blot，結果顯示，該重組蛋白能夠與抗6×His標簽的單克隆抗體反應，表明該蛋白為帶有6×His標簽的重組rNS2目的蛋白（圖2）。

圖1 BTV-16 S8基因的PCR擴增Fig.1 Amplification of BTV-16 S8 gene by PCR

圖2 重組質粒pPro-NS2在BL21菌中的誘導表達和鑒定Fig.2 Expression of recombinant plasmid pPro-NS2 in E.coli BL21

2.3 重組rNS2蛋白的可溶性分析及純化 超聲破碎后提取的沉淀中含有大量目的蛋白，上清液中僅有少量可溶性目的蛋白（圖3），表明重組rNS2蛋白主要以包涵體的形式表達。在沉淀樣品中加入變性裂解緩沖液，通過Ni柱親和層析純化包涵體蛋白，收集洗脫液。SDS-PAGE分析顯示，不同時間收集的洗脫蛋白雜帶很少，且獲得的目的蛋白條帶大小與預期相符，利用ImageJ軟件進行灰度分析表明，rNS2的純度達到91.6%（圖3）。

圖3 重組rNS2蛋白的可溶性分析和純化Fig.3 Solubility analysis and purification of recombinant rNS2 protein

2.4 NS2抗體的特異性 將純化的rNS2蛋白與弗氏佐劑乳化后，對新西蘭大白兔進行3次免疫，獲得抗NS2蛋白的多抗血清。為了檢測NS2抗血清的特異性，以NS2抗血清為一抗，對誘導表達的重組rNS2蛋白和BTV-1感染C6/36細胞中的天然NS2蛋白進行Western blot分析。結果顯示，NS2抗血清可與rNS2發(fā)生特異性反應，同時也可與天然NS2蛋白發(fā)生特異性反應（圖4A），而陰性兔血清則未顯示出目的蛋白的條帶（圖4B）。由于rNS2蛋白含有6×His標簽和部分多克隆位點序列，因此rNS2蛋白分子量約48 kDa，較天然NS2蛋白分子量（約42 kDa）稍大，這與預期結果相符。由此可見，制備的NS2多克隆抗體具有很好的反應性和特異性。

2.5 NS2蛋白在BTV-1感染C6/36細胞中的表達分布以制備的NS2抗血清為一抗，通過細胞免疫熒光實驗檢測BTV-1感染C6/36細胞中NS2蛋白的表達分布。結果顯示，在BTV-1感染后24 h和48 h的C6/36細胞中均觀察到了紅色熒光，表明本實驗制備的NS2抗體可用于感染細胞中NS2蛋白的免疫熒光染色，且NS2蛋白表達分布于整個細胞質（圖5B2、5C2），而未感染BTV-1的C6/36細胞未檢測到紅色熒光（圖5A2）。

圖4 NS2蛋白多克隆抗體的特異性檢測Fig.4 Specificity analysis of polyclonal antibodies against rNS2 protein

3 討論

病毒包涵體（virus inclusion body，VIB）是病毒感染細胞后復制和組裝的主要場所[12]。NS2蛋白是BTV VIB的重要組成部分，單獨表達的NS2蛋白或GFP-NS2蛋白可在細胞質內形成VIB，提示NS2形成VIB不需要其他病毒蛋白的參與[13]。NS2蛋白上的三個基序位點（2-11位、153-166位和274-286位氨基酸）能夠結合病毒的單鏈RNA，但不結合雙鏈RNA和DNA[7]。已有研究表明，BTV感染細胞2 h后，病毒mRNA即可進行蛋白質的翻譯, 病毒單鏈RNA與NS2形成的VIB結合，不同基因片段與蛋白產物在VIB內進行裝配，此過程也涉及VP3、VP1、VP4、VP6和NS2蛋白之間的相互作用[1,14]。這些研究表明NS2在病毒的復制和核心粒子裝配過程中起關鍵作用[15-16]。為深入探索NS2蛋白的生物學功能，本研究實現了NS2蛋白在原核表達系統(tǒng)中的高效表達，制備了特異性的兔抗NS2多克隆抗體。該抗體不僅能與rNS2蛋白反應，而且能與BTV感染細胞中的天然NS2蛋白反應。制備的多克隆抗體既可用于免疫印跡實驗，也可應用于細胞免疫熒光實驗，具有較高的特異型和反應性。

圖5 C6/C36細胞中NS2蛋白的IFA檢測結果Fig.5 IFA results of NS2 protein in C6/C36

NS2是BTV編碼蛋白中唯一的磷酸化蛋白，由細胞的酪蛋白激酶2進行磷酸化修飾，其磷酸化作用可能與穩(wěn)定NS2蛋白C末端結構域的蛋白折疊有關[17-18]。近來研究發(fā)現，在Hela細胞中蛋白磷酸酶2A參與了NS2蛋白的去磷酸化，而且與酪蛋白激酶2共同調節(jié)VIB的組裝/去組裝以及病毒復制，當NS2上249位和259位絲氨酸（磷酸化位點）突變成丙氨酸后，抑制了其磷酸化和低聚化，突變體BTV的復制能力明顯低于野生型BTV[7,19]。白紋伊蚊細胞C6/36是研究BTV的常用細胞系，BTV作為蟲媒病毒感染C6/36細胞后不能產生細胞病變，但是能完成正常的復制和增殖，然而BTV感染Hela細胞后可產生明顯的細胞病變[20]。本研究免疫熒光結果表明，BTV感染C6/36細胞后NS2蛋白表達分布于整個細胞質，這與NS2在VIB形成過程中與細胞內的微管發(fā)生共定位的研究結果相符[7]。然而，BTV感染Hela細胞和昆蟲細胞C6/36后NS2蛋白的磷酸化/去磷酸化及其VIB的組裝/去組裝機制有何不同，需要更深入的研究。

BTV編碼的非結構蛋白（NS1、NS2、NS3/NS3A和NS4）在不同血清型之間是比較保守的[16,21]。本研究成功表達了BTV-16 NS2蛋白并制備了抗體，檢測結果證明該抗體不僅與BTV-16 NS2反應，同時可與BTV-1 NS2天然蛋白具有良好的反應性。序列分析顯示BTV-1和BTV-16 NS2序列的核苷酸和氨基酸相似性分別為80%和88%，而BTV-16與其他血清型病毒NS2的同源性均接近于或高于BTV-1，由此推測該抗體也可與其他血清型BTV的NS2蛋白反應?；贜S2在BTV不同血清型之間的保守性，NS2蛋白也已應用于亞單位疫苗的研制中，這可以提高疫苗對不同血清型病毒的交叉保護。已有研究證明NS1和NS2能夠誘導特異性的體液免疫和細胞免疫[22-23]。本研究表達的rNS2蛋白和制備的兔抗NS2多克隆抗體將有助于深入研究NS2蛋白的功能和作用機制。