李慧春，陳鵬飛，李先斌，丁思嘉，王 康，張文超，楊德強(qiáng)，李 林，徐晶晶，虞凌雪，姜一峰，高 飛，于 海，童光志,3，周艷君,3

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 上海 200241；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

豬小腸上皮細(xì)胞是消化道的主要功能性細(xì)胞，在食物的消化吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)中均發(fā)揮作用。同時，它也是豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬delta冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）等多種臨床多發(fā)的腸道傳染病病原在體內(nèi)感染的共同靶細(xì)胞[1,2]。其中，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）由于發(fā)生了一些新的變異，成為近年來對我國養(yǎng)豬業(yè)危害較為嚴(yán)重的一種重要傳染病病原，PEDV屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），α-冠狀病毒屬（α-Coronavirus），是單股正鏈有囊膜的RNA病毒，主要感染哺乳仔豬，引發(fā)水樣腹瀉、脫水、嘔吐等癥狀，可導(dǎo)致感染哺乳仔豬死亡[3-4]。PEDV同時可以感染其他月齡的豬，引起其不同程度的癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。已有研究證實(shí)豬小腸上皮細(xì)胞是PEDV體內(nèi)感染的靶細(xì)胞[7]。PEDV感染后，病理切片可見腸絨毛萎縮、破損、脫落，病原入侵靶細(xì)胞后，通過內(nèi)吞作用和細(xì)胞融合進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制[8-9]。在此過程中，宿主細(xì)胞的蛋白會與病毒基因組編碼的蛋白發(fā)生一系列相互作用，從而促進(jìn)或拮抗病毒的感染、增殖[10-11]。研究宿主體內(nèi)與PEDV互作蛋白的關(guān)系有助于揭示PEDV的致病機(jī)理，而酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)相互作用的重要方法之一，其主要是在建立宿主細(xì)胞酵母cDNA文庫的基礎(chǔ)上，構(gòu)建包含特定病毒基因的誘餌質(zhì)粒，使其與文庫雜交后，在選擇性培養(yǎng)基上篩選能夠與病毒基因編碼的蛋白發(fā)生相互作用的宿主細(xì)胞蛋白。本研究擬構(gòu)建豬小腸上皮細(xì)胞的酵母雙雜交cDNA文庫，以便于后續(xù)在此基礎(chǔ)上篩選和鑒定與PEDV互作的相關(guān)宿主蛋白，進(jìn)一步為研究PEDV致病機(jī)理提供保障。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒與單抗 豬小腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs）傳代細(xì)胞系、PEDV變異株FJzz1/2011和PEDV N蛋白單抗均由本實(shí)驗(yàn)室保存、分離和制備[12-14]。

1.2 主要試劑 “Mate & Plate” Library System cDNA文庫構(gòu)建試劑盒、SD/-Leu缺陷型培養(yǎng)基、Yeast Transformation System 2轉(zhuǎn)化試劑盒、Advantage 2 Polymerase Mix、PCR Mix、Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞均購自TaKaRa公司、FITC標(biāo)記的驢抗小鼠IgG、TRIzol試劑、MEM培養(yǎng)基、FBS、PBS等購自Thermo公司。

1.3 IECs細(xì)胞培養(yǎng)及接毒 利用含10%FBS的MEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)IECs傳代細(xì)胞系，待細(xì)胞在6孔板形成細(xì)胞單層時，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次后，將PEDV FJzz1/2011株用含有10 μg/mL胰酶的MEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋后接種于IECs細(xì)胞單層上，于37℃、5% CO2條件下孵育1 h，棄去培養(yǎng)液，經(jīng)PBS洗滌后，用含有10 μg/mL胰酶的MEM培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，同時設(shè)未接毒細(xì)胞為對照，實(shí)時在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。

1.4 間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescence assay，IFA） 將產(chǎn)生細(xì)胞病變的IECs棄去培養(yǎng)基，經(jīng)PBS清洗兩遍后，使用80%冷乙醇進(jìn)行細(xì)胞固定，于4℃固定1 h，棄去固定液，PBS清洗2遍，加入1∶1000稀釋的抗PEDV N蛋白單抗，37℃孵育1 h，棄去一抗，用PBS清洗3遍；加入1∶800稀釋的FITC標(biāo)記的驢抗小鼠IgG，置于37℃避光孵育1 h，用PBS清洗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 細(xì)胞總RNA的提取及檢測 將生長良好的IECs用10 mL PBS清洗2遍，使用細(xì)胞刮刀刮取貼壁的IECs，并用2mL PBS重懸，經(jīng)4℃ 1500×g離心5 min，棄去PBS，加入1mL Trizol試劑，吹打重懸細(xì)胞，靜置15 min。加入200 μL的氯仿，充分渦旋混勻，待管內(nèi)液體分層，靜置15 min后，在4℃條件下12 000×g離心15 min；取上層清液約500 μL，加入500 μL的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，4℃條件下12 000×g離心15 min；棄上清，加入75%乙醇1mL，輕輕渦旋混勻，4℃條件下7500×g離心5 min；重復(fù)3次，棄上清，干燥10 min后，用50 μL DEPC處理水重懸RNA。取2 μL RNA測定濃度，同時取2 μL RNA，加入8 μL ddH2O稀釋，加入2 μL 6×loading buffer， 利用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.6 cDNA文庫的構(gòu)建

1.6.1 第一鏈cDNA合成 在1.5 mL離心管中加入2 μLRNA樣本、1 μL的CDS III引物、1 μL的去離子水，總體積為4 μL；使用1 μL的poly A+ RNA設(shè)置陽性對照組，72℃孵育2 min；之后冰浴2 min，14 000×g下離心10 s；加入2 μL 5×第一鏈緩沖液、1μL DTT（100 mmol/L）、1μL dNTP Mix、1μL SMART MMLV，42℃孵育10 min；加入1 μL SMART III-modified Oligo，混合并在42℃下孵育1 h，放置在75℃下10 min，終止第一鏈cDNA的合成反應(yīng)，冷卻至室溫，并加入1 μL RNase H，37℃孵育20 min，獲得的第一鏈cDNA，用于下一步擴(kuò)增。

1.6.2 LD-PCR擴(kuò)增cDNA和純化 以上述獲得的第一鏈cDNA為模板，配制100 μL的PCR體系，體系如下：第一鏈 cDNA 2 μL，ddH2O 70 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer10μL，50×dNTP Mix 2μL，10×Melting Solution 10 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 2 μL，5' Primer和3' Primer各2μL，混勻后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR程序如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，68℃延伸 6 min（每個循環(huán)延伸時長增加5 s），共25個循環(huán)。

預(yù)先將CHROMA SPIN TE-400濾柱內(nèi)的膠質(zhì)基質(zhì)混勻，將其放置在2 mL收集管上，在室溫下經(jīng)700×g水平離心5 min，將濾柱轉(zhuǎn)移至新的收集管上，并將上述LD-PCR擴(kuò)增的cDNAs樣品加至濾柱的基質(zhì)中央；經(jīng)700×g水平離心5 min，獲取收集管內(nèi)液體；加入1/10體積的3 mol/L的醋酸鈉溶液，然后加入2.5倍體積的冷乙醇，于-20℃放置1 h；室溫下14 000×g離心20min，棄上清；再次離心，盡棄殘液；自然干燥10 min；用20 μL的去離子水重懸cDNAs。

1.6.3 轉(zhuǎn)化 將Carrier DNA在95℃～100℃加熱5 min變性，然后迅速冰浴冷卻；在無菌、預(yù)冷的15 mL離心管內(nèi)加入20 μL ds cDNAs（2～5μg）、pGADT7-Rec 3 μg、Carrier DNA 20μL，加入600 μL Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞并輕輕混勻，在加入2.5 mL PEG/LiAc，輕輕混勻，于30℃孵育45 min，每10～15 min輕輕混勻一次；然后加入160 μL DMSO并混勻；置于42℃水浴20 min，每5～10 min輕輕混勻一次；700×g離心5 min沉淀酵母細(xì)胞；棄上清，然后加入3 mL YPDA Plus培養(yǎng)液重懸，250 rpm 30℃振蕩培養(yǎng)90 min，再經(jīng)700×g離心5 min，棄上清，用15 mL 0.9% NaCl溶液重懸菌體；分別做10倍和100倍稀釋后涂布在100 mm SD/-Leu固體培養(yǎng)平板上；剩余的菌體按照150 μL/板涂布在150 mm的SD/-Leu固體培養(yǎng)平板上，30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。

1.6.4 cDNA文庫菌液的收集 待涂布在SD/-Leu平板上的菌落長至2～3 mm后，將培養(yǎng)板置于4℃冷卻3～4 h，每板加入5 mL的含有25%甘油的YPDA培養(yǎng)基，用無菌玻璃棒將菌落刮下來，置于500 mL的無菌三角瓶中混勻，取10 μL滴在載玻片上，在顯微鏡下對菌落進(jìn)行計數(shù)，將獲得的文庫菌液按1 mL/管分裝，于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 IECs cDNA文庫庫容量鑒定 取文庫10 μL，分別做5000倍和10 000倍稀釋，慢渦旋混勻，涂于100 mm SD/-Leu缺陷型平板上，30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，對菌落進(jìn)行計數(shù)并計算其庫容量。

1.8 IECs cDNA文庫質(zhì)量鑒定 隨機(jī)挑取文庫上的菌落，將其作為模板，加入25 μL PCR Mix 2，24 μL ddH2O，94℃預(yù)變性1 min，98℃變性10 sec，68℃退火延伸 3 min，進(jìn)行30個反應(yīng)，取5 μL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，對插入片段的長度進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PEDV感染IECs的細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）觀察 IECs在PEDV FJzz1/2011株感染24 h后即可見明顯的細(xì)胞核聚集、細(xì)胞膜融合形成多核體的典型細(xì)胞病變效應(yīng)，隨著感染時間的延長，細(xì)胞逐漸死亡脫落。利用PEDV N蛋白單抗對感染后的IECs進(jìn)行間接免疫熒光檢測，結(jié)果顯示感染后的IECs呈明顯的亮綠色熒光（圖1）。

2.2 IECs總RNA的檢測 將利用TRIzol試劑提取IECs的總RNA進(jìn)行濃度和完整性測定，結(jié)果顯示，本研究提取的IECs總RNA樣品濃度為1671 ng/μL，其OD260/OD280=2.01，OD260/OD230=2.26；對提取的IECs的RNA經(jīng)適當(dāng)稀釋后，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，可見28S、18S和5S的3個清晰的條帶（圖2）。

2.3 LD-PCR擴(kuò)增cDNAs和純化 利用LD-PCR技術(shù)對獲得的IECs的第一鏈cDNAs進(jìn)行擴(kuò)增，并對其產(chǎn)物利用CHROMA SPIN TE-400濾柱進(jìn)行純化處理，同時以試劑盒提供的ploy A+反轉(zhuǎn)錄獲得的第一鏈cDNAs作為對照，對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，IECs第一鏈cDNAs擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在泳道內(nèi)彌散狀分布，且純化處理后條帶為250～2500 bp（圖3）。

圖2 豬小腸上皮細(xì)胞總RNA電泳分析Fig.2 Gel electrophoresis of the extracted total RNA of IECs

圖3 LD-PCR擴(kuò)增和cDNAs純化Fig.3 Amplification and purification of the target cDNAs

2.4 IECs cDNA文庫庫容量鑒定 按照試劑盒提供的計算方法進(jìn)行文庫滴度計算，文庫容量=菌落數(shù)/（涂布體積×稀釋倍數(shù)）。將文庫菌落做10-6和10-7稀釋經(jīng)計算，在10-6稀釋的培養(yǎng)基上菌落數(shù)為130個，而10-7稀釋的菌落數(shù)為26個，經(jīng)計算本研究構(gòu)建的豬小腸上皮細(xì)胞cDNA文庫容量為1.3×108pfu/mL（圖4）。

圖4 不同濃度稀釋的IECs-cDNA文庫菌落生長情況Fig.4 Colony morphology of IECs-cDNA library at different dilutions

2.5 IECs cDNA文庫質(zhì)量鑒定 取構(gòu)建完成的IECs cDNA文庫菌液10 μL涂布于100 mm的SD/-Leu平板上，30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，隨機(jī)選取35個菌落，進(jìn)行菌液PCR，結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增陽性率達(dá)100%，且PCR產(chǎn)物的大小為250～2500 bp，且呈多樣性，表明本研究構(gòu)建的cDNA文庫，符合其評價標(biāo)準(zhǔn)（圖5）。

圖5 豬小腸上皮細(xì)胞cDNA文庫菌落PCR檢測Fig.5 PCR detection of colonies of IECs-cDNA Library

3 討論

豬小腸上皮細(xì)胞（IECs）位于小腸腸道內(nèi)的最表層，不僅可以促進(jìn)食物的消化吸收，也是阻擋腸道病原感染重要屏障，由于IECs在腸道內(nèi)是病原最先接觸細(xì)胞，容易成為腸道病毒攻擊的主要靶細(xì)胞，而針對病毒的感染IECs會迅速產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答進(jìn)行防御，因此IECs在機(jī)體抗病毒天然免疫反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用。PEDV是引起豬嚴(yán)重腹瀉的腸道病毒，IECs是其宿主細(xì)胞，但關(guān)于IECs如何調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答保護(hù)細(xì)胞免受腸道病毒感染的研究尚缺乏。雖然已證實(shí)Vero細(xì)胞可廣泛用于PEDV體外分離和繁殖[15]，Marc-145細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）以及HEK-293細(xì)胞等是允許PEDV感染的替代細(xì)胞系[16-17]，當(dāng)然，不同類型的細(xì)胞PEDV感染效率不同，其發(fā)揮作用途徑也可能不同。然而，由于Vero細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞等細(xì)胞與IECs的種屬來源不同，前三者屬于非宿主來源細(xì)胞，這些非宿主來源細(xì)胞不能準(zhǔn)確模擬PEDV在宿主體內(nèi)感染IECs的具體情況，不適合用于研究PEDV與宿主之間的相互作用，而作為靶細(xì)胞的豬小腸上皮細(xì)胞成為最佳的宿主模型候選細(xì)胞。

酵母雙雜交技術(shù)是利用酵母雙雜交cDNA文庫篩選互作蛋白的較為成熟的技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。在本研究中，我們首先使用PEDV FJzz1/2011株體外感染豬小腸上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在PEDV感染后24 h就可以觀察到被感染的IECs呈現(xiàn)細(xì)胞膜融合、核聚集、形成多核體等典型細(xì)胞病變，證實(shí)本研究選用的IECs可以在體外條件下被PEDV感染，該細(xì)胞可以作為建庫使用的首選目標(biāo)。我們大量培養(yǎng)了宿主細(xì)胞IECs，提取包含IECs的總RNA，檢測結(jié)果證實(shí)獲得的總RNA純度較高，且完整性較好。利用SMART技術(shù)識別mRNA的polyA尾進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取IECs細(xì)胞中各種編碼蛋白對應(yīng)的cDNA，將其擴(kuò)增后與pGADT7-Rec共同轉(zhuǎn)入酵母Y187菌株，利用酵母細(xì)胞高重組率的特性將二者進(jìn)行重組。同時，在純化cDNAs的過程中，使用CHROMA SPIN+TE-400 Columns對擴(kuò)增后的cDNAs進(jìn)行純化，以減少無意義小片段，有助于在后續(xù)雙雜交實(shí)驗(yàn)中排除小片段對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，從而提高cDNA文庫的質(zhì)量。通過文庫容量計算，確定本實(shí)驗(yàn)所建立的IECs-cDNA文庫容量為1.3×108pfu/mL，大于2×107/mL文庫標(biāo)準(zhǔn)，且通過PCR對文庫的質(zhì)量進(jìn)行鑒定結(jié)果證實(shí)，IECs-cDNA文庫豐富度高、多態(tài)性良好，陽性重組率可達(dá)100%，符合文庫合格的標(biāo)準(zhǔn)。本研究構(gòu)建的IECs-cDNA文庫可以作為PEDV與小豬腸上皮細(xì)胞互作蛋白篩選研究的候選文庫，為后續(xù)研究PEDV與靶細(xì)胞蛋白互作機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。