池秋燕，宿 鑫，李雪松，碩 盾，滕巧泱，楊健美，劉芹防，陳鴻軍，李澤君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，動(dòng)物傳染病不斷爆發(fā)，不僅給我國(guó)的經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失，對(duì)動(dòng)物生命以及人類健康也帶來(lái)嚴(yán)峻的威脅[1]。近年來(lái)我國(guó)出現(xiàn)了一種以發(fā)病鴨精神萎靡、站立不穩(wěn)、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩為主要特征的新發(fā)傳染性疾病[2]。該新發(fā)疫病的易感動(dòng)物為櫻桃谷鴨，發(fā)病日齡主要集中在10～25日齡，少數(shù)鴨群于5～14日齡也有發(fā)病的癥狀。該病一年四季均可發(fā)生流行，發(fā)病率不高，由早期的0.1%～0.5%逐步提升至現(xiàn)在的10%～15%。

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)采集發(fā)病鴨的實(shí)質(zhì)性器官，經(jīng)病毒分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)等方法，分離出1株未知病毒。經(jīng)電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該病毒粒子直徑為70～100 nm，有囊膜包裹。經(jīng)核酸鑒定[3]，確定該病毒為1種新型的RNA病毒，并命名為鴨生長(zhǎng)遲緩病毒（Duck growth retardation virus）Anhui2株[4-5]。

雖然該病毒不致死鴨子，但是能引起鴨子生長(zhǎng)緩慢，殘次率升高，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此建立一種針對(duì)該新發(fā)疫病的快速檢測(cè)方法，確定其流行情況及病毒在宿主體內(nèi)的分布情況，可為該疾病的預(yù)防控制提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 病毒、細(xì)胞株及血清 鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存[4]；小鼠骨髓瘤細(xì)胞株（SP2/0）由本實(shí)驗(yàn)室保存；陰、陽(yáng)性質(zhì)控血清由本實(shí)驗(yàn)室保存；鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株陽(yáng)性血清和陰性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備、保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡和8～12周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.3 主要試劑 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、PEG1500、HAT、HT購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；TMB顯色液購(gòu)自武漢博士德公司。

1.4 病毒抗原的制備 將鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株接種于9日齡SPF雞胚的尿囊腔中，棄去12 h內(nèi)死亡的胚，并收集死亡雞胚的尿囊液，經(jīng)0.2%甲醛滅活。將雞胚尿囊液在4℃下以8000×g離心30 min后，取上清經(jīng)15 000×g高速離心1 h后，再取上清經(jīng)170 000×g超速離心5 h后，沉淀用PBS（pH 7.4）溶解后，通過(guò)20%、40%、60%蔗糖梯度離心，收集40%～60%蔗糖層之間的白色條帶[6]，進(jìn)行脫糖取沉淀，最后病毒沉淀用PBS懸浮，用作免疫抗原或包被抗原。

1.5 間接ELISA方法的建立 采用方陣滴定法[7]確定間接ELISA方法中包被抗原和陽(yáng)性血清最佳濃度。將純化的鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株抗原、鼠陽(yáng)性血清和陰性血清分別作倍比稀釋，選擇OD450在1.0左右，且P/N值最大的抗原和血清濃度作為其最佳工作濃度[8-11]。

1.6 鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）的制備 參照參考文獻(xiàn)[12-13]方法，用純化的鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株與等量弗氏完全佐劑乳化后，經(jīng)腹部和背部皮下多點(diǎn)接種6周齡雌性BALB/c小鼠（200 μL/只）；每隔2周，用純化的病毒加入等量弗氏不完全佐劑乳化后，分別進(jìn)行第2次和第3次免疫，免疫劑量和首免相同；3免2周后，皮下注射相同劑量的不加佐劑的Anhui2株病毒，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。當(dāng)小鼠的抗體效價(jià)達(dá)到1∶104以上時(shí)，取抗體效價(jià)最高的小鼠脾臟用于細(xì)胞融合。

1.7 細(xì)胞融合和篩選 在加強(qiáng)免疫后d3，按常規(guī)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)[14-15]將小鼠的脾細(xì)胞分離，使用50%PEG與SP2/0細(xì)胞融合。將融合的細(xì)胞接種在96孔板中，在次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至25%～75%時(shí)，采用間接ELISA檢測(cè)融合細(xì)胞分泌的McAb。雜交瘤細(xì)胞需要在96孔板中亞克隆3次。

1.8 單克隆抗體腹水的制備和效價(jià)測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16-17]，取8～12周齡BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5 mL滅菌液體石蠟。7～10 d后腹腔注入3×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7～10 d可見(jiàn)小鼠腹部明顯膨大。采取腹水，12 000×g離心10 min，收集上清液，采用1.5建立的ELISA方法檢測(cè)腹水的抗體效價(jià)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 McAb中和活性的測(cè)定 通過(guò)病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)中和活性[18]。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水經(jīng)56℃滅活30 min，10倍稀釋后進(jìn)行倍比稀釋，分別與含有100 ELD50的鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株等體積混合，置37℃作用1 h，經(jīng)尿囊腔接種9日齡雞胚；同時(shí)抗鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株鼠陽(yáng)性血清及SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照?？梢种?0%病毒增殖的抗體的最高稀釋倍數(shù)即為抗體中和效價(jià)。

1.10 阻斷ELISA方法的建立 抗原包被的濃度和McAb 1-5的最佳稀釋度通過(guò)棋盤滴定來(lái)確定。用400倍稀釋的純化病毒包被ELISA板，用碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH9.6）4℃溫育過(guò)夜；用含有0.05%Tween-20、pH7.4的PBS洗滌抗原包被板，并用200 μL封閉緩沖液（含5%脫脂乳的PBS）37℃封閉1 h。血清樣品用PBS進(jìn)行2倍、5倍、10倍、20倍稀釋，每塊板都設(shè)有陽(yáng)性和陰性對(duì)照。每孔加入稀釋的血清樣品100 μL，37℃溫育1 h。用PBST洗滌3次，再與McAb 1-5在37℃溫育1 h。用PBST沖洗孔3次后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，在室溫下孵育1 h。用PBST沖洗3次，再加入100 μL TMB，并在室溫下溫育8 min。加入50 μL的2mol/L硫酸終止反應(yīng)。阻斷率PI（%）=1 -測(cè)試血清的OD450/陰性對(duì)照血清的OD450×100%。利用316份未感染鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株的鴨血清樣本，用于確定陽(yáng)、陰性血清樣品的臨界值。臨界值確定為陰性血清PI的平均值+2倍或3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，確保95%或99%陰性血清樣品的PI值在該范圍內(nèi)。

1.11 特異性試驗(yàn) 采用1.10檢測(cè)方法依次對(duì)Ⅰ型鴨肝炎病毒（Duck Hepatitis virus type Ⅰ， DHAV-Ⅰ，編號(hào)N1）、Ⅲ型鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus type Ⅲ，DHAV-Ⅲ，編號(hào)N2）、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV，編號(hào)N3）、鴨瘟病毒（Duck enteritis virus，DEV，編號(hào)N4）、鴨呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV，編號(hào)N5）、新型鴨細(xì)小病毒（Novel duck parvovirus，NDPV，編號(hào)N6）、番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV，編號(hào)N7）、鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV，編號(hào)N8）陽(yáng)性血清和4份鴨陰性質(zhì)控血清（編號(hào)N9～N12）進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)PI值確定其特異性。

1.12 敏感性試驗(yàn) 將鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株陽(yáng)性血清倍比稀釋為1∶10～1∶1280，用1.10建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算PI值確定其敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的建立 利用淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，通過(guò)間接ELISA方法對(duì)融合孔細(xì)胞進(jìn)行篩選、鑒定和亞克隆純化，共獲得2株能夠穩(wěn)定分泌抗鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別將其命名為1-5和3-6G。

2.2 雜交瘤細(xì)胞上清和腹水效價(jià)的測(cè)定 將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水分別進(jìn)行10倍系列稀釋，用1.5建立的間接ELISA方法測(cè)定OD450，同時(shí)設(shè)立鼠陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照。P/N值≥2.1時(shí)McAb的最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價(jià)。

表1 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水抗體效價(jià)Table1 Antibody titer of hybridoma cell supernatant and mice ascites

2.3 McAb中和活性的測(cè)定 中和試驗(yàn)結(jié)果表明，獲得的兩株單抗均具有中和鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株的活性。McAb 1-5細(xì)胞培養(yǎng)上清的中和抗體效價(jià)達(dá)1∶40，腹水中和抗體效價(jià)達(dá)1∶80。McAb 3-6G細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水的中和抗體效價(jià)均為1∶40。

2.4 阻斷ELISA反應(yīng)條件的確定

2.4.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定將鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株分別稀釋為1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600進(jìn)行包被，陽(yáng)性血清與陰性血清分別稀釋為1∶2、1∶5、1∶10、1∶20，進(jìn)行阻斷ELISA試驗(yàn)，各個(gè)稀釋度包被病毒與被檢血清的 OD450和阻斷率見(jiàn)表2。結(jié)果表明，病毒稀釋400倍，血清稀釋10倍作為被檢對(duì)象時(shí)，陽(yáng)性血清和陰性血清的OD450都比較理想，阻斷率比較高。

表2 抗原和血清最佳稀釋度的篩選Table2 The best dilution of coating antigen and serum

2.4.2 待檢血清作用時(shí)間的確定 使用最佳條件包被和封閉ELISA板后，加入最佳稀釋濃度的陰、陽(yáng)性血清，37℃分別作用1 h、1.5 h和2 h，對(duì)陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行阻斷ELISA試驗(yàn)，各個(gè)時(shí)間陰、陽(yáng)性血清阻斷結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，血清作用時(shí)間為1 h時(shí)，陽(yáng)性血清的阻斷率最高，阻斷效果最好，所以選擇1 h為最佳血清作用時(shí)間。

表3 血清最佳作用時(shí)間Table 3 The optimal reaction time of serum

2.4.3 單克隆抗體工作濃度的確定 使用最佳條件包被和封閉ELISA板后，加入最佳稀釋度的陰、陽(yáng)性血清，37℃分別作用1 h，將McAb 1-5稀釋為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80后進(jìn)行阻斷ELISA試驗(yàn)。結(jié)果顯示，McAb 1-5稀釋20倍時(shí)，阻斷效果最好（表4），所以選擇1∶20作為McAb最佳稀釋度。

表4 單克隆抗體（腹水）最佳稀釋度的篩選Table 4 The best dilution of McAb

2.5 阻斷ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 對(duì)316份制備的陰性鴨血清樣品進(jìn)行阻斷ELISA檢測(cè)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出血清樣品的平均阻斷率（x）為1.9%，標(biāo)準(zhǔn)差（s）為8.0%，x+ 2s=17.9%，x+3s=26.0%；當(dāng)PI≥26.0%時(shí)判定該血清為鴨生長(zhǎng)遲緩病毒抗體陽(yáng)性，PI≤17.9%時(shí)判定為該血清抗體陰性，17.9%＜PI＜26.0%時(shí)判為可疑，需重復(fù)檢測(cè)1次，如果仍低于26.0%則判定為血清抗體陰性。

2.6 特異性試驗(yàn) 在特異性檢驗(yàn)中，陰、陽(yáng)性對(duì)照血清的檢測(cè)結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果可信。12份特異性陰性質(zhì)控血清的PI值均小于17.9%，判定為陰性（表5）。

表5 阻斷ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Specificity test of blocking ELISA

2.7 敏感性試驗(yàn) 將鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋，用建立的阻斷ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，血清稀釋40倍后仍檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性（PI值＞26.0%），而80倍稀釋的陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果為陰性（PI值＜17.9%）（表6）。

表6 阻斷ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Sensitivity test of blocking ELISA

3 討論

鴨生長(zhǎng)遲緩病毒在實(shí)驗(yàn)條件下可造成鴨生長(zhǎng)遲緩，體重下降，與發(fā)病鴨場(chǎng)出現(xiàn)的不同程度的生長(zhǎng)遲緩相吻合。目前對(duì)該新發(fā)病的流行、傳播和病原分類均知之甚少，有效的血清學(xué)監(jiān)測(cè)對(duì)于監(jiān)測(cè)這種新出現(xiàn)的鴨病毒至關(guān)重要。本研究以Anhui2株全病毒作為抗原，篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗鴨生長(zhǎng)遲緩病毒，具有較好的特異性和敏感性的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究該病毒致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[19-21]。

在單克隆抗體的制備過(guò)程中，會(huì)影響細(xì)胞融合效果因素很多，其中最為重要的是SP2/0細(xì)胞的狀態(tài)。因此在融合前，應(yīng)該先用 8-AG 處理細(xì)胞，使融合時(shí)的骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，有利于提高細(xì)胞融合的效率和成功率[14]。我們成功制備了抗鴨生長(zhǎng)遲緩病毒Anhui2株的單克隆抗體，通過(guò)中和試驗(yàn)表明該單抗具有中和活性，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)鴨血清樣品中針對(duì)鴨生長(zhǎng)遲緩病毒抗體的阻斷ELISA。本研究中固相載體上包被的是純化的滅活鴨生長(zhǎng)遲緩病毒。加入待檢樣品中若無(wú)Anhui2株抗體，1-5則與固相載體上的鴨生長(zhǎng)遲緩病毒結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顏色變化。如果樣品中含有鴨生長(zhǎng)遲緩病毒，可與McAb 1-5結(jié)合后經(jīng)洗滌除去，與固相載體上的鴨生長(zhǎng)遲緩病毒結(jié)合的McAb 1-5量變小，則產(chǎn)生的顏色變淺。隨著樣品中鴨生長(zhǎng)遲緩病毒量的增大，顏色就越淺，達(dá)到完全阻斷的含量后，則不能產(chǎn)生顏色變化。通過(guò)顏色變化可以定性，通過(guò)酶標(biāo)儀讀數(shù)，則可以定量。

阻斷ELISA方法具有很多優(yōu)勢(shì)，能大量測(cè)試樣品并且適用多個(gè)物種，具有更高的靈敏度、特異性和便捷度，廣泛運(yùn)用于動(dòng)物傳染病的監(jiān)測(cè)和病毒抗體的臨床或?qū)嶒?yàn)室檢測(cè)[9-11]。本研究建立的檢測(cè)鴨血清樣品中鴨生長(zhǎng)遲緩病毒抗體的阻斷ELISA方法，具有良好的特異性和敏感性，對(duì)我國(guó)鴨生長(zhǎng)遲緩病毒病的流行病學(xué)調(diào)查及診斷具有重要的意義。