郭 帥，范志宇，王 芳，朱偉峰，仇汝龍，魏后軍，胡 波，宋艷華，陳萌萌，徐為中

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014）

沙門氏菌病是由不同種沙門氏菌引起不同宿主疾病的總稱，可以誘發(fā)動(dòng)物的傷寒、副傷寒、腹瀉、流產(chǎn)等疾病以及人的腹瀉、傷寒、敗血癥、食物中毒、副傷寒等[1]。沙門氏菌屬于腸道桿菌，在人畜公共衛(wèi)生方面具有十分重要的意義[2-3]。根據(jù)調(diào)查顯示，全世界范圍內(nèi)的食物中毒病例中以沙門氏菌為誘因的占據(jù)前而位[4-6]。在我國由于加工食品攜帶沙門氏菌而引起食物中毒的病例占首位[7-10]。沙門氏菌病被發(fā)現(xiàn)至今，主要依靠抗生素類藥物治療和預(yù)防，尤其是20世紀(jì)中期，抗生素被大量濫用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，已經(jīng)成為全世界亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一。目前，針對(duì)禽源和人源沙門氏菌的研究較多，對(duì)于家兔沙門氏菌病的研究與報(bào)道相對(duì)較少。我國是兔肉生產(chǎn)與出口的第一大國，家兔沙門氏菌病的發(fā)生和流行，不僅會(huì)帶來嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問題，也會(huì)給家兔產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2016年2～5月，山東某兔場(chǎng)發(fā)生腸炎沙門氏菌病[11]。2017年2月份開始，該兔場(chǎng)又出現(xiàn)母兔發(fā)生流產(chǎn)、死亡，新生仔兔、幼兔死亡的臨床現(xiàn)象，剖檢以脾臟腫大為特征病變，使用多種藥物都未起到明顯效果?；诖艘咔椋覀儗?duì)該兔場(chǎng)和周邊兔場(chǎng)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查并制備了疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。結(jié)果顯示：通過對(duì)大量樣本檢測(cè)，我們篩選出一套快速、準(zhǔn)確的兔腸炎沙門氏菌檢測(cè)法；分離菌株為ST.11序列型，存在較強(qiáng)的耐藥性；疫苗免疫可以較好地防控腸炎沙門氏菌病再次發(fā)生。本研究為腸炎沙門氏菌病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效方法，為腸炎沙門氏菌病的防控提供了實(shí)用性方案。

1 材料與方法

1.1 樣本 山東某兔場(chǎng)（甲兔場(chǎng)）繁殖母兔的新鮮糞便和乳汁、流產(chǎn)死胎、兔舍環(huán)境樣本、飼料、水源；分兔場(chǎng)（乙兔場(chǎng)）繁殖母兔的新鮮糞便、流產(chǎn)死胎；山東省其他兔場(chǎng)（丙兔場(chǎng)）繁殖母兔的新鮮糞便。

1.2 培養(yǎng)基與主要試劑 改良馬丁肉湯培養(yǎng)基、0.1%無菌蛋白胨水溶液（BPW）、膽硫乳瓊脂（DHL）、三糖鐵瓊脂、四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(chǔ)（TTB）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、氯化鎂孔雀綠肉湯（MM）和亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）均購自青島高科園海博生物科技有限公司，抗菌藥物藥敏紙片、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自杭州微生物試劑有限公司，Taq酶購自TaKaRa公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物 引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.1 腸炎沙門氏菌特異性引物 Usef A-F：5'-ATG CGTAAATCAGCATCTG-3'；Lsef A-R：5'-TTAGT TTTGATACTGCTGAAC-3'。

1.3.2 MLST分型反應(yīng)引物[12]針對(duì)腸炎沙門氏菌的分型有7對(duì)特異性引物，包括hisD、aroC、hemD、sucA、dnaN、purE、thrA（表1）。

表1 用于MLST分型的引物Table 1 Primers used for MLST

1.4 臨床調(diào)查和取樣 詢問發(fā)病兔場(chǎng)既往病史、發(fā)病情況、藥物使用情況，對(duì)病死兔進(jìn)行臨床解剖、觀察和取樣，采集新鮮的糞便和乳汁；對(duì)兔場(chǎng)周邊環(huán)境進(jìn)行調(diào)查取樣，包括兔籠、兔舍、周轉(zhuǎn)箱、飼料、水源等。

1.5 沙門氏菌選擇性培養(yǎng)[13]

1.5.1 預(yù)增菌 將無菌采集的樣品接種于5 mL的BPW中，37℃培養(yǎng)18～24 h。

1.5.2 選擇性增菌 從培養(yǎng)后的BPW中吸取500 μL，分別接種于TTB、MM、SC三種選擇性增菌液中，增菌液各5 mL，MM與SC放置37℃培養(yǎng)18～24 h，TTB放置42℃ 培育18～24 h。

1.5.3 分離培養(yǎng) 用接種環(huán)將菌液分別劃線接種于DHL平板和BS平板，DHL平板放置37℃培育22～24 h，BS平板放置37℃培育40～48 h，觀察單菌落形態(tài)特征。

1.6 生化特性 根據(jù)國家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)-沙門氏菌檢驗(yàn)》[14]，用改良馬丁肉湯對(duì)疑似沙門氏菌單菌落培養(yǎng)，并進(jìn)行生化特性分析，分別接種于三糖鐵瓊脂斜面、硫化氫、靛基質(zhì)、尿素、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶、甘露醇、ONPG等微量生化反應(yīng)管，37℃ 培養(yǎng)24 h，觀察并記錄。

1.7 腸炎沙門氏菌特異性PCR鑒定與序列測(cè)定 對(duì)疑似沙門氏菌單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，以腸炎沙門氏菌作為陽性對(duì)照，以陰性菌株為陰性對(duì)照，以蒸餾水為空白對(duì)照。反應(yīng)體系：2×Mix 10.0 μL，上下游引物各0.5 μL，挑取單菌落，加dd H2O至總體積20.0 μL。反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性4 min；95℃變性15 s，52℃ 退火30 s，72℃ 延伸40 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸1 min。用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，電壓120V，時(shí)間30 min，用凝膠成像系統(tǒng)處理圖像，切膠回收目的片段，送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.8 MLST分型[15]對(duì)從甲兔場(chǎng)、乙兔場(chǎng)和丙兔場(chǎng)糞便分離的3株腸炎沙門氏菌進(jìn)行MLST分型比較試驗(yàn)。提取細(xì)菌基因組DNA，用7個(gè)管家基因所對(duì)應(yīng)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：Taq酶0.5 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，加ddH2O至總體積50.0 μL。反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性4 min；94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸4 min。用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，將鑒定為陽性的產(chǎn)物送往南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行序列結(jié)果比對(duì)，分別將7對(duì)序列輸入MLST數(shù)據(jù)庫（https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_mlst_seqdef&set_id=2&page=profiles&scheme_id=2），并對(duì)序列型進(jìn)行分析。

1.9 藥敏試驗(yàn) 分別取來自3個(gè)兔場(chǎng)分離的4株腸炎沙門氏菌培養(yǎng)物100 μL均勻涂布于馬丁平板，選取14種藥敏試紙片貼于平板內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)抑菌圈直徑判斷耐藥性。抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感；直徑大于10 mm且小于15 mm為中度敏感；直徑小于10 mm為不敏感或耐藥。

1.10 疫苗免疫預(yù)防 針對(duì)甲兔場(chǎng)的發(fā)病情況，用分離菌在本實(shí)驗(yàn)室自制滅活疫苗，對(duì)兔場(chǎng)母兔進(jìn)行一次免疫和兩次免疫試驗(yàn)。一次免疫的母兔，免疫2 mL/只；兩次免疫的母兔，首免2 mL/只，間隔2周進(jìn)行二次免疫，1 mL/只。在首次免疫后1個(gè)月內(nèi)，觀察新生仔兔死亡率；每隔兩周采取新鮮糞便進(jìn)行腸炎沙門氏菌檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床調(diào)查和取樣 山東某兔場(chǎng)（甲兔場(chǎng)）于2017年2月份開始發(fā)病，病情與2016年相似[11]，以兩幢兔舍（A舍、B舍）病情最為嚴(yán)重。11日齡新生仔兔死亡率突然升高；每幢兔舍約900只種兔，仔兔數(shù)量約7000余只，每日仔兔正常死亡數(shù)應(yīng)在10只以內(nèi)，突然升高至50只以上，嚴(yán)重時(shí)段達(dá)100只以上，使用阿奇霉素、安普霉素、替米考星等藥物效果不明顯；部分懷孕母兔出現(xiàn)流產(chǎn)、死亡現(xiàn)象，陰道黏膜紅腫，有膿性分泌物流出，病理剖檢以脾臟腫大為主，其他實(shí)質(zhì)性器官未發(fā)現(xiàn)明顯肉眼可見病變（圖1）。

圖1 臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms

2.2 選擇性培養(yǎng)研究 采集樣品經(jīng)預(yù)增菌后于選擇性增菌液TTB、MM、SC中培養(yǎng)后，接DHL平板和BS平板培養(yǎng)，DHL平板上的陽性沙門氏菌菌落為無色半透明菌落，有黑色中心或幾乎全部為黑色，有些菌株無黑色中心；BS平板上的陽性菌落呈棕褐色或灰色，有金屬光澤，有些菌株形成灰綠色菌落。經(jīng)分析比較，MM選擇性增菌液的陽性檢出率要明顯低于TTB和SC（表2）。

2.3 生化特性 沙門氏菌分離菌生化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，所有分離菌均符合腸炎沙門氏菌的生化特性（表3）。

表2 沙門氏菌檢出率Table 2 Positive rates of Salmonella

表3 生化檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of biochemical test

2.4 腸炎沙門氏菌特異性PCR鑒定 用腸炎沙門氏菌特異性引物對(duì)疑似沙門氏菌單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的基因片段大小為498 bp，與目的基因片段大小相同（圖2），序列測(cè)定結(jié)果與目的序列一致，可以判定本次沙門氏菌病的病原體為腸炎沙門氏菌。

圖2 菌落PCR結(jié)果Fig.2 Results of bacterial colony PCR

2.5 不同樣品檢測(cè)結(jié)果 兔場(chǎng)的糞便檢測(cè)均有陽性，其中甲兔場(chǎng)的A舍糞便檢出率相對(duì)較高，達(dá)到73.33%；乳汁中也檢測(cè)到腸炎沙門氏菌的存在，流產(chǎn)死胎的陽性檢出率100%，在兔舍環(huán)境樣本、飼料和水源中未檢測(cè)到腸炎沙門氏菌。

表4 不同種類樣品腸炎沙門氏菌陽性率Table 4 Positive rates of Salmonella Enteritidis indifferent sorts of samples

2.6 MLST分型 對(duì)從甲兔場(chǎng)、乙兔場(chǎng)和丙兔場(chǎng)糞便分離的3株腸炎沙門氏菌進(jìn)行MLST分型比較試驗(yàn)并進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，甲兔場(chǎng)、乙兔場(chǎng)和丙兔場(chǎng)菌株為同一序列型，都是ST.11（圖3、表5）。

2.7 藥敏試驗(yàn) 對(duì)分離的4株腸炎沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)青霉素、鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥性最高，對(duì)頭孢噻肟、丁胺卡那和氟苯尼考的敏感性最高。細(xì)菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重（表6）。

圖3 MLST分型方法中7個(gè)看家基因的PCR結(jié)果Fig.3 PCR products of 7 housekeeping genes in MLSTM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); A: 甲兔場(chǎng)菌株; B: 乙兔場(chǎng)菌株; C:丙兔場(chǎng)菌株. 泳道1～7, 8～14, 15～21對(duì)應(yīng)的看家基因依次為hisD,aroC, hemD, sucA, dnaN, purE, thrAM: DNA Marker(DL2000); A: Warren A; B: Warren B; C: Warren C. Lane 1-7, 8-14, 15-21 corresponds to housekeeping genes are hisD, aroC, hemD, sucA, dnaN, purE, thrA, respectively

表5 MLST分型結(jié)果Table 5 Results of MLST

表6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（單位：mm）Table 6 Results of drug susceptibility test (unit: mm)

2.8 疫苗免疫效果 經(jīng)疫苗免疫后，甲兔場(chǎng)的病情得到有效控制。新生仔兔死亡率明顯降低，腸炎沙門氏菌陽性檢出率明顯下降。兩次免疫效果優(yōu)于一次免疫效果（表7）。

表7 免疫前后腸炎沙門氏菌檢出率Table 7 Detection rates of Salmonella Enteritidis pre- and post- immunization

3 討論

通過對(duì)大量樣品的檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析，本研究篩選出一套快速、準(zhǔn)確的兔腸炎沙門氏菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)法。對(duì)3種選擇性增菌液的陽性檢出率進(jìn)行比較，其中，TTB和SC選擇性增菌液的陽性檢出率相同，MM選擇性增菌液的陽性檢出率較低，與孔繁德[13]之前的研究報(bào)告基本相符。在后期大量樣品檢測(cè)試驗(yàn)中，我們淘汰了MM選擇性增菌液，對(duì)選擇性增菌液TTB和SC，我們同時(shí)使用或二者選其一，提高試驗(yàn)效率，結(jié)合相關(guān)生化試驗(yàn)和特異性菌落PCR鑒定，可以用于臨床上大批量樣品的檢測(cè)，效果良好。利用優(yōu)化后的方法對(duì)甲兔場(chǎng)、乙兔場(chǎng)和丙兔場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和MLST分型比較。檢測(cè)結(jié)果表明，不同兔場(chǎng)糞便陽性細(xì)菌檢出率分別為73.33%、40.00%、30.30%、31.25%，說明家兔發(fā)病期間，普遍通過腸道途徑向外排出病原；分離菌株呈現(xiàn)嚴(yán)重的多重耐藥性，且不同兔場(chǎng)間的耐藥情況差異明顯，推測(cè)與各兔場(chǎng)抗生素使用的情況有關(guān)；3個(gè)兔場(chǎng)的沙門氏菌分離菌株經(jīng)分型比較結(jié)果顯示，菌株均為ST.11序列型，推測(cè)可能該類型菌有較強(qiáng)的傳播能力，在當(dāng)?shù)爻实胤叫粤餍谢蛘吣竿脕碓从谕粋€(gè)種兔場(chǎng)；新鮮乳汁、死亡仔兔和死胎中也檢測(cè)到腸炎沙門氏菌，說明腸炎沙門氏菌病可以通過胎盤垂直傳播，在禽沙門氏菌病的傳播途徑中，通過蛋垂直傳播為主。

沙門氏菌病屬于人獸共患病，危害嚴(yán)重。由于多年來大規(guī)模使用抗生素治療沙門氏菌病，沙門氏菌的耐藥問題日益嚴(yán)重。因此，科學(xué)合理的預(yù)防尤為重要。本次發(fā)病兔場(chǎng)使用多種抗生素，治療效果不明顯。在使用自制滅活疫苗進(jìn)行一次免疫和兩次免疫后，病情得到有效控制。而且兩次免疫效果優(yōu)于一次免疫效果，說明對(duì)沙門氏菌病的防控，疫苗免疫相對(duì)于抗生素的治療，更具優(yōu)勢(shì)。

本次發(fā)病兔場(chǎng)的規(guī)?；潭雀?、管理制度系統(tǒng)完整、日常消毒安排合理，但仍出現(xiàn)嚴(yán)重的沙門氏菌感染。這種情況除了與沙門氏菌自身生存能力強(qiáng)、易感染外，說明兔場(chǎng)可能在日常管理、消毒過程中仍存在一定盲點(diǎn)。要徹底消除此病，兔場(chǎng)還需加強(qiáng)對(duì)外來引進(jìn)種兔的病原監(jiān)測(cè)力度，實(shí)行嚴(yán)格的糞污處理措施，制定合理的免疫防控計(jì)劃等，最終達(dá)到凈化此病的目標(biāo)。