戎國棟 趙鴻 吳蕾 黃珮珺 王芳 張燕 徐婷

近年來，隨著磁珠分離技術(shù)在病毒核酸檢測領(lǐng)域的普及應(yīng)用，很多公司推出了全自動核酸提取儀［1］。此類儀器利用磁珠法進行核酸提取純化，提高了核酸提取的效率，降低人工操作誤差，實現(xiàn)了病毒核酸的高敏高通量檢測，在臨床分子檢驗中得到了廣泛關(guān)注［2-3］，但其檢測性能尚待進一步驗證。由于乙型肝炎病毒核酸（hepatitis B virus DNA，HBV-DNA）檢測為臨床分子實驗室最常見的檢測項目，本文以HBV-DNA 定量檢測為例，通過對6 套全自動核酸提取儀的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性相關(guān)性、檢測下限、防污染能力和開放能力的臨床驗證，旨在建立適用于全自動核酸提取儀臨床選擇和評價的驗證方案，為實驗室實現(xiàn)HBV-DNA 定量檢測全自動化流程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品準(zhǔn)備

采用陰性血清將106IU/mL 濃度水平的乙型肝炎病毒核酸（HBV-DNA）血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司）稀釋至1×104IU/mL、1×103IU/mL、1×102IU/mL、5×101IU/mL、2×101IU/mL和1×101IU/mL，分別編號為A、B、C、D、E 和F，每個濃度梯度若干管，1 mL/管分裝，-70℃凍存。

1.1.2 儀器與試劑

6 個國內(nèi)外主流品牌全自動核酸提取儀，采用ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀（ThermoFisher，美國）進行擴增，COBAS Ampliprep & Taqman 48 系統(tǒng)（Roche，瑞士）作為定量參考。檢測試劑為各廠商配套的乙型肝炎病毒核酸提取和擴增試劑盒。系統(tǒng)開放性評價中采用上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。

1.2 方法

1.2.1 防污染能力

HBV-DNA 定量結(jié)果為107IU/mL 濃度水平的臨床血清樣品若干份混合，分裝；HBV-DNA 檢測陰性樣本混合，分裝。在全自動提取儀中以陰陽相間的方式排列，用6 個品牌全自動核酸提取系統(tǒng)提取HBV-DNA，熒光定量PCR 檢測，觀察其防污染能力。

1.2.2 準(zhǔn)確性試驗

采用羅氏COBAS Ampliprep & Taqman 48 系統(tǒng)及6 個品牌全自動核酸提取系統(tǒng)對樣品A-F 進行HBV-DNA 定量檢測，每個濃度梯度重復(fù)檢測2 次，取均值。通過比較各品牌儀器在對應(yīng)濃度檢測結(jié)果的偏倚（待評價系統(tǒng)檢測結(jié)果平均數(shù)的對數(shù)值-羅氏結(jié)果平均數(shù)的對數(shù)值）對準(zhǔn)確性進行評價。

1.2.3 重復(fù)性試驗

A（1×104IU/mL）與C（1×102IU/mL）2 個濃度梯度的樣品平行提取5 次后，進行熒光定量PCR 檢測，通過極差（5 次結(jié)果中最高值的對數(shù)值-最低值的對數(shù)值）評價各儀器重復(fù)性。

1.2.4 檢測下限

分析各品牌儀器所能檢測出的最低檢測濃度并計算檢出率。

1.2.5 線性相關(guān)性

以羅氏測定值為X，各品牌檢測系統(tǒng)測定值為Y，對樣品A-F 共6 個濃度梯度檢測結(jié)果計算線性范圍及線性相關(guān)系數(shù)R2。

1.2.6 開放性試驗

采用第三方HBV-DNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒，ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀，對各品牌儀器提取的樣品A-F 的模板進行擴增，評價檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、檢測下限以及線性相關(guān)性，并與配套檢測系統(tǒng)比較。

2 結(jié)果

2.1 防污染能力

檢測結(jié)果顯示，5 種品牌儀器的高濃度陽性樣本均檢出，陰性標(biāo)本均未檢出，防污染性能高。僅有一個品牌儀器陰性標(biāo)本均呈現(xiàn)低濃度檢出，平均Ct 值為30.56，平均檢測值為6.04×101IU/mL，防污染測試未通過，停止后續(xù)驗證。

2.2 準(zhǔn)確性試驗

檢測結(jié)果與羅氏結(jié)果的對數(shù)值差值位于±0.4之間時，準(zhǔn)確性較高。配套系統(tǒng)中品牌一和品牌四準(zhǔn)確性較高（表1），開放性系統(tǒng)中品牌一的準(zhǔn)確性最高（表2）。

表1 5 種品牌儀器配套系統(tǒng)的準(zhǔn)確性結(jié)果（偏倚，log）Table 1 Accuracy results of 5 instruments with matching systems（Bias，log）

表2 5 種品牌儀器開放性系統(tǒng)的準(zhǔn)確性結(jié)果（偏倚，log）Table 2 Accuracy results of 5 instruments with open systems（Bias，log）

2.3 重復(fù)性試驗

A（1×104IU/mL）與C（1×102IU/mL）2 個濃度的樣品分別用配套系統(tǒng)和開放性系統(tǒng)平行提取5 次后，進行熒光定量PCR 檢測，其5 次結(jié)果的極差如表3所示。配套系統(tǒng)測試中，品牌一、品牌二的重復(fù)性結(jié)果相當(dāng)；但在開放性系統(tǒng)中，品牌一的重復(fù)性顯著優(yōu)于其他品牌。

表3 5 種品牌儀器的重復(fù)性結(jié)果（極差，log）Table 3 Repeatability results for 5 instruments（Range，log）

2.4 檢測下限

低值樣品E（2×101IU/mL）和F（1×101IU/mL）的檢出率如表4所示，樣品A-D 在各品牌儀器中的檢出率均為100%。配套系統(tǒng)中，品牌一和品牌五對低值樣品檢出率較高，而開放性系統(tǒng)中品牌一低值樣品檢出率最佳。

表4 5 種品牌儀器的檢測下限Table 4 Limit of detection for 5 instruments

2.5 線性相關(guān)性

線性范圍以羅氏值為X，實際測定值為Y，在101～104IU/mL 范圍內(nèi)，自動核酸提取、實時熒光定量PCR 擴增方法線性范圍內(nèi)均良好。配套系統(tǒng)中，品牌一至品牌五的線性相關(guān)性R2分別為0.980、0.992、0.998、0.990、0.964，其中品牌三線性相關(guān)性系數(shù)最佳，見圖1。開放性系統(tǒng)中，品牌一至品牌五的線性相關(guān)性R2分別為0.991、0.977、0.976、0.920、0.974，其中品牌一線性相關(guān)性系數(shù)最佳，見圖2。

圖1 配套系統(tǒng)，品牌三與羅氏檢測結(jié)果線性相關(guān)性Figure 1 Matching system，linear correlation between Brand 3 and Roche system

圖2 開放性系統(tǒng)，品牌一與羅氏檢測結(jié)果線性相關(guān)性Figure 2 Open system，linear correlation between Brand 1 and Roche system

2.6 開放性試驗

由上述結(jié)果可見，系統(tǒng)開放性評價中，采用第三方擴增試劑檢測的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和檢測下限普遍低于配套檢測系統(tǒng)，其中品牌一在各檢測參數(shù)中均表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，開放性最佳。

3 討論

近年來，核酸檢測已成為臨床分子實驗中經(jīng)常使用研究手段之一，其質(zhì)量優(yōu)劣直接影響后續(xù)實驗的成敗。因此，核酸提取成為分子生物學(xué)實驗中的關(guān)鍵步驟。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸提取技術(shù)也從最初的手工提取發(fā)展到全自動核酸提取，同時解決了傳統(tǒng)手工法操作復(fù)雜、重復(fù)性差、通量低等問題。目前，市場上的全自動核酸提取儀品牌繁多，性能參差不齊。根據(jù)CNAS-CL02：《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO15189：2012）及CNAS-CL36：2012《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》［4-5］要求，臨床實驗室在引入新的檢測方法或檢測系統(tǒng)時，需驗證其在本實驗室能否達(dá)到廠家聲明的性能［6］。因此，本研究從準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性相關(guān)性、檢測下限、防污染能力和開放能力6個方面對目前市場上常見的6 款全自動核酸提取儀的性能進行了臨床驗證，制定了全自動核酸提取儀的性能驗證方案，以期在眾多的儀器品牌中挑選出更適用于臨床分子檢測領(lǐng)域的儀器及為實驗室后續(xù)新檢測儀器的引入提供參考方案。

我國作為乙肝大國，HBV-DNA 檢測已成為臨床分子實驗室中的常規(guī)檢測項目，因此本研究選擇HBV-DNA 為評價指標(biāo)對6 款全自動核酸提取儀進行性能驗證。對于全自動核酸提取儀的性能驗證，近年來陸續(xù)有文獻報道，但一次性對多款儀器及多指標(biāo)同步進行性能驗證的類似研究尚未有先例。本研究中通過儀器試劑配套實驗，結(jié)果表明品牌一、四與羅氏結(jié)果偏倚最小，準(zhǔn)確性佳；羅氏定量檢測系統(tǒng)具有靈敏度、精確度和可重復(fù)性高的優(yōu)點，被國際公認(rèn)為HBV-DNA 定量檢測的參比試劑。本研究結(jié)果與李莉華等［7］在不同檢測系統(tǒng)中應(yīng)用國產(chǎn)核酸檢測試劑研究結(jié)果相符，這可能與不同試劑盒廠家采購的原材料及生產(chǎn)水平差異相關(guān)。此外，本研究重復(fù)性實驗結(jié)果顯示品牌一、二對樣品A（1×104IU/mL）與C（1×102IU/mL）的檢測結(jié)果極差小，重復(fù)性佳；品牌一、五對樣品F（1×101IU/mL）的檢出率為100%，高于其他品牌；品牌三線性相關(guān)系數(shù)為0.998，均大于其他品牌，表明其與羅氏檢測結(jié)果相關(guān)性最佳；而在開放性實驗中，其準(zhǔn)確性、重復(fù)性和檢測下限均低于配套系統(tǒng)，但品牌一在各檢測參數(shù)中顯示了最佳的檢測性能。在已發(fā)表的文獻中，有從靈敏度、精密度［8］、檢出率、精密度、重復(fù)性分別對核酸提取儀進行性能評價［9］的研究，還有對其臨床可行性進行驗證的研究［10］，這些研究結(jié)果都提示核酸提取儀具有操作簡單、快速、提取效率高的優(yōu)點，值得臨床檢驗推廣，與本研究結(jié)果相符。但在已有的研究中并未有從橫向?qū)Χ嗥放苾x器之間差異的研究，在此基礎(chǔ)上本文對6 個品牌核酸提取儀進行了性能評價，其中儀器品牌涵蓋了主流進口品牌與國產(chǎn)品牌，且本次研究中參與實驗的研究人員跨省市開展實驗、采集數(shù)據(jù)；實驗結(jié)果顯示開放性系統(tǒng)中品牌一為最優(yōu)提取儀，配套系統(tǒng)中每個品牌各有優(yōu)勢，可以根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪x擇不一樣的儀器進行實驗，為臨床分子實驗室對核酸提取儀的選擇和評價提供參考和指導(dǎo)。

本研究的創(chuàng)新點還在于，首次采用了第三方擴增試劑盒評價檢測系統(tǒng)開放性，有利于擴增試劑的多項選擇，對后續(xù)自建檢測項目的開展及科研應(yīng)用也具有一定意義。本研究已從橫向多指標(biāo)對多品牌核酸提取儀進行了評價，為了更全面、更完善地了解核酸提取系統(tǒng)的臨床檢測性能，后續(xù)研究可以增加對全自動核酸提取系統(tǒng)的抗干擾能力（如溶血、脂血、黃疸等）［11］、對不同基因型HBV核酸檢測能力［12-13］等方面的研究進一步評估檢測系統(tǒng)的應(yīng)用性能。

綜上所述，經(jīng)過本次性能評價，品牌一全自動核酸提取儀在配套系統(tǒng)和開放性試驗中均表現(xiàn)良好，顯著優(yōu)于其他品牌，與Roche 定量檢測系統(tǒng)在各指標(biāo)上無明顯差異，鑒于其明顯的價格優(yōu)勢，有利于臨床推廣應(yīng)用。本性能驗證方案在全自動核酸提取儀的臨床選擇和評價中有效可行。