韓俊 趙靜 張立群

結(jié)直腸癌是一種發(fā)病率和死亡率均較高的消化道惡性腫瘤，手術(shù)根治性切除目前仍是其治療的重要手段，而麻醉是手術(shù)過程中的重要部分，作為常用的靜脈注射麻醉藥——丙泊酚是否影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展逐漸引起人們的關(guān)注［1］。隨著研究的深入，除了對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到催眠和鎮(zhèn)靜作用外，丙泊酚在食管癌、胃癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤治療過程中還表現(xiàn)出較好的抑瘤作用［2-4］。已有研究證實丙泊酚可通過抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的途徑抑制結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展，但具體的作用機(jī)制尚不完全清晰［5-6］。miR-133a 是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的小分子RNA，被證實在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，而上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7-8］。有研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可通過上調(diào)miR-133a 的表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但其是否通過影響miR-133a 表達(dá)參與調(diào)控結(jié)直腸癌增殖凋亡的分子機(jī)制并不清楚［9］。因此，本研究以結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞為研究對象，觀察丙泊酚對HCT116 細(xì)胞增殖凋亡的影響，探討其對miR-133a表達(dá)的調(diào)控，為進(jìn)一步闡明丙泊酚改善結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞株購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI-1640 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Hyclone 公司，胎牛血清購于美國Gibco 公司，脂質(zhì)體2000 和Trizol 試劑購于美國Invitrogen 公司。二甲基亞楓、丙泊酚和噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑美國Sigma-Aldrich 公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購于美國GE Health care Life Science 公司，增 強(qiáng) 化 學(xué) 發(fā) 光（enhancedchemiluminescence，ECL）檢測試劑盒購于美國GE health care 公司，miR-133a inhibitor（貨號：miR3012）、miR-133a mimics（貨號：miR1008）及其相應(yīng)的陰性對照購于廣州銳博生物科技有限公司。性別決定基因相關(guān)HMG 盒基因4（SRY-related HMG-box4，SOX4）抗體（貨號：A-ABV10137）購于艾美捷科技有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（貨號：2218）購于美國Cell signaling 公司。青霉素-鏈霉素、膜聯(lián)蛋白V-FITC（annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium Iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于北京百奧萊博公司。恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購于日本三洋公司，7900HT real-time PCR 儀購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，DYC-31D 型電泳儀購于北京六一儀器廠，CEL-DOC2000 型紫外凝膠成像3 系統(tǒng)購于美國Bio-Rab 公司。流式細(xì)胞儀購于美國BD Biosciences 公司。

1.2 HCT116 細(xì)胞培養(yǎng)

將液氮中裝有HCT116 細(xì)胞的凍存管置于溫水浴中快速溶解后，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入RPMI-1640 培養(yǎng)基吹打混勻。以1 000 rpm 離心5 min，棄上清后以含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。以25 cm2的培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞，并放置于5% CO2、飽和濕度的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上時，加入0.25%胰蛋白酶消化，并按照1∶3 比例傳代。實驗所有HCT116 細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.3 MTT 法測定HCT116 細(xì)胞增殖情況

每孔200 μL HCT116 細(xì)胞懸液（含30 000 個細(xì)胞）接種于96 孔細(xì)胞板上。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜后，給予濃度為0、1、5 和10 μg/mL 丙泊酚，每孔設(shè)置4 個復(fù)孔。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24、48 和72 h 后，以MTT 法檢測細(xì)胞在λ=570 nm 處的吸光度OD 值，具體方法參照文獻(xiàn)［2］。

1.4 流式細(xì)胞儀測定HCT116 細(xì)胞凋亡情況

詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)［6］，實驗重復(fù)測定3 次。

1.5 real-time PCR 測定HCT116 細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)情況

采用Trizol 法提取HCT116 細(xì)胞的總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板按照94℃30 s，94℃5 s、58℃30 s，共38 個循環(huán)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其中，由上海吉凱生物公司合成的PCR 引物如下：miR-133a F：5′-CTGCATTGGTCCCCTTCAAC- 3′ 和R：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA - 3′ 和 R：5′ - AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.6 Western blot 測定HCT116 細(xì)胞中SOX4 蛋白的表達(dá)情況

詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)［6］，其中SOX4 抗體和GAPDH 抗體工作液以1∶500 稀釋，而二抗工作液是按1∶2 000 稀釋。實驗重復(fù)測定3 次。

1.7 HCT116 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將HCT116 細(xì)胞以每孔20 000 個細(xì)胞接種至6 孔細(xì)胞板上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞融合度在70%以上時，參照脂質(zhì)體2000 說明書步驟將50 nM miR-133a inhibitor 及其陰性對照轉(zhuǎn)染至HCT116 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h 更換新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)24 h。miR-133a 低表達(dá)影響HCT116 細(xì)胞實驗：隨機(jī)分為對照組（未做任何處理）、丙泊酚組（給予濃度為10 μg/mL 丙泊酚作用48 h）、丙泊酚+anti-miR-133a 組（轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor 后給予10 μg/mL 丙泊酚作用48 h）和丙泊酚+ anti-miRNC 組（轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor 陰性對照后給予10 μg/mL 丙泊酚作用48 h）。給藥處理結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，采用real-time PCR 測定miR-133a 的表達(dá)，Western blot 測定SOX4 蛋白的表達(dá)，MTT 法和流式細(xì)胞儀分別檢測各組細(xì)胞的增殖和凋亡情況。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灉y定miR-133a 與SOX4 的靶向關(guān)系

構(gòu)建野生型（SOX4-WT）和突變型（SOX4-MUT）的SOX4 的3′-UTR 熒光素酶報告載體。將HCT116 細(xì)胞以每孔20 000 個細(xì)胞接種至24 孔細(xì)胞板上，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)過夜。將其分為miR-133a+SOX4-MUT 組（共轉(zhuǎn)染miR-133a mimics和SOX4-MUT 質(zhì)粒）、miR-133a + SOX4-WT 組（共轉(zhuǎn)染miR-133a mimics 和SOX4-WT 質(zhì)粒）、NC+SOX4-MUT（共轉(zhuǎn)染miR-133a mimics 陰性對照和SOX4-MUT 質(zhì)粒）、NC+SOX4-WT 組（共轉(zhuǎn)染miR-133a mimics 陰性對照和SOX4-WT 組）。根據(jù)上述分組參照脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟將miR-133a mimics 及其陰性對照分別與SOX4-MUT質(zhì)粒、SOX4-WT 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HCT116 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集各組細(xì)胞參照試劑盒說明書步驟檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。實驗重復(fù)檢測3 次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以x±s形式表示，3 組組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗，2 組組間采用獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚抑制HCT116 細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡

與對照（0 μg/mL）相比，1 μg/mL 異丙酚對HCT116 細(xì)胞增殖無顯著影響（P＞0.05），但5 μg/mL異丙酚從48 h 開始抑制HCT116 細(xì)胞增殖，10 μg/mL 異丙酚從24 h 開始抑制HCT116 細(xì)胞增殖（P＜0.05）；丙泊酚對HCT116 細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，且呈濃度-時間依賴性，結(jié)果見圖1A。同時，與0 μg/mL 相比，5 μg/mL 和10 μg/mL 丙泊酚能夠呈濃度依賴性誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞凋亡（P＜0.05），而1 μg/mL 異丙酚對HCT116 細(xì)胞凋亡無明顯影響。見圖1B 和C。

2.2 丙泊酚促進(jìn)HCT116 細(xì)胞中miR-133a 表達(dá)而抑制SOX4 蛋白表達(dá)

與0 μg/mL 相比，5 μg/mL 和10 μg/mL 丙泊酚顯著促進(jìn)HCT116 細(xì)胞中miR-133a（P＜0.05），且呈濃度依賴性；而1 μg/mL 丙泊酚對miR-133a 表達(dá)無顯著影響（P＞0.05），結(jié)果見圖2A。同時，5 μg/mL 和10 μg/mL 丙泊酚處理后HCT116 細(xì)胞中SOX4 蛋白的表達(dá)較0 μg/mL 明顯降低（P＜0.05），而以1 μg/mL丙泊酚處理后SOX4 蛋白的表達(dá)與0 μg/mL 處理組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2B和C。

圖1 丙泊酚對HCT116 細(xì)胞增殖凋亡的影響Figure 1 Effects of propofol on proliferation and apoptosis of HCT116 cells

2.3 SOX4 是miR-133a 的靶基因

圖2 丙泊酚對HCT116 細(xì)胞中miR-133a 和SOX4蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effects of propofol on the expression of miR-133a and SOX4 protein in HCT116 cells

采用TargetScan 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-133a 與SOX4 3′UTR 存在互補(bǔ)結(jié)合位點，結(jié)果見圖3A；與SOX4-WT 共轉(zhuǎn)染的miR-133a 組細(xì)胞的熒光素酶活性較NC 組明顯降低（P＜0.05），而與SOX4-MUT共轉(zhuǎn)染的miR-133a 組和NC 組之間熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見圖3B。

2.4 miR-133a 低表達(dá)逆轉(zhuǎn)丙泊酚對HCT116 細(xì)胞中SOX4 蛋白表達(dá)的抑制作用

與對照組相比，丙泊酚組、丙泊酚+anti-miRNC 組和丙泊酚+anti-miR-133a 組細(xì)胞中miR-133a表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+anti-miR-133a 組細(xì)胞中miR-133a 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而丙泊酚+anti-miR-NC 組和丙泊酚組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖4A。同時，丙泊酚組、丙泊酚+anti-miR-NC 組和丙泊酚+anti-miR-133a 組細(xì)胞中SOX4 蛋白的表達(dá)水平較對照組明顯降低（P＜0.05），且丙泊酚+anti-miR-133a 組高于丙泊酚組（P＜0.05）。結(jié)果見圖4B 和C。

圖3 miR-133a 與SOX4 靶向關(guān)系的驗證結(jié)果Figuer 3 Verification of the targeting relationship between miR-133a and SOX4

2.5 miR-133a 低表達(dá)逆轉(zhuǎn)丙泊酚對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用

與對照組相比，丙泊酚處理下HCT116 細(xì)胞增殖能力顯著受到抑制（P＜0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+anti-miR-133a 組細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；而丙泊酚+anti-miR-NC 組與丙泊酚組比較無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見圖5A。同時，丙泊酚組細(xì)胞凋亡能力較對照組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），但丙泊酚+anti-miR-133a 組細(xì)胞凋亡能力較丙泊酚組顯著減弱（P＜0.05），而丙泊酚+anti-miR-NC 組與丙泊酚組相比無顯著變化（P＞0.05）。見圖5B 和C。

3 討論

圖4 miR-133a 低表達(dá)對丙泊酚作用下HCT116 細(xì)胞中SOX4 蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of low expression of miR-133a on SOX4 expression in HCT116 cells induced by propofol

丙泊酚是一種常用的靜脈注射麻醉藥，在腫瘤手術(shù)過程中的作用不容忽視。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)顯示，丙泊酚在改善腫瘤患者預(yù)后和延長生存期方面具有積極作用［10-12］。Yang等［13］和Xing 等［14］發(fā)現(xiàn)，低濃度的丙泊酚能夠降低脂多糖誘導(dǎo)的HIF-1α、ROS 上調(diào)，改善腫瘤微環(huán)境，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞侵襲、遷移；另外，還可通過ERK1/2 途徑上調(diào)PUMA 表達(dá)抑制癌細(xì)胞活性和誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展。Yu 等［15］研究發(fā)現(xiàn)低濃度的丙泊酚可通過抑制miR-24/p27 信號通路誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-435 細(xì)胞凋亡；Peng 等［16］報道顯示，丙泊酚可通過上調(diào)miR-451 影響MMP-2 的表達(dá)抑制胃癌SGC-7901 細(xì)胞的增殖和加速凋亡?？梢?，低濃度的丙泊酚可通過復(fù)雜多樣的分子機(jī)制在抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著一定的積極作用。

圖5 miR-133a 低表達(dá)對丙泊酚作用下HCT116 細(xì)胞增殖凋亡的影響Figure 5 Effect of low expression of miR-133a on proliferation and apoptosis of HCT116 cells induced by propofol

目前，丙泊酚在結(jié)直腸癌中的研究已有報道。例如：余海燕等［5］研究得到的丙泊酚能夠抑制結(jié)直腸癌LoVo 細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究在結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞中進(jìn)一步驗證了上述結(jié)果。根據(jù)上述資料顯示，丙泊酚可通過調(diào)控miRNAs如miR-451 和miR-24 等參與其抑腫瘤機(jī)制。miRNAs 是一類短小的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過與靶mRNAs 的3’UTR 結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等多種生物學(xué)過程。miR-133a 是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA，被證實在胃癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中異常低表達(dá)，而其過表達(dá)可通過調(diào)控相關(guān)靶基因如USP39和LASP1等發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖和增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的作用［17-19］；既往研究證實miR-133a 在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用；miR-133a 在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，且扮演著腫瘤抑制因子的角色［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能夠促進(jìn)HCT116 細(xì)胞中miR-133a 的表達(dá)。該結(jié)果與Wang 等［6］在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)的丙泊酚可通過上調(diào)miR-133a 表達(dá)的結(jié)果相吻合。結(jié)果提示，miR-133a 可能參與丙泊酚調(diào)控結(jié)直腸癌增殖和凋亡的分子機(jī)制。

SOX4 是SOX 轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要成員，在多種腫瘤組織或細(xì)胞中異常高表達(dá)，而干擾其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［20］。既往研究證實SOX4 也在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用；靶向抑制異常高表達(dá)的SOX4 可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和體外侵襲［21］。本研究還發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能夠抑制HCT116 細(xì)胞中SOX4 的表達(dá)。該結(jié)果與Du等［22］在子宮內(nèi)膜癌的研究中發(fā)現(xiàn)的丙泊酚可抑制SOX4 的表達(dá)的結(jié)果相一致。這提示SOX4 可能在丙泊酚調(diào)控結(jié)直腸癌增殖和凋亡過程中扮演著重要角色。

另外，本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-133a 與SOX4 3′ UTR 存在互補(bǔ)結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實SOX4是miR-133a 的靶基因。這與Li 等［23］在食管癌的研究中證實SOX4是miR-133a 的靶基因的結(jié)果相吻合。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor 成功下調(diào)miR-133a表達(dá)后進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，miR-133a 低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)丙泊酚對HCT116 細(xì)胞增殖和SOX4 蛋白表達(dá)的抑制作用以及對HCT116 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。結(jié)果提示，丙泊酚可通過上調(diào)miR-133a 進(jìn)而抑制其靶基因SOX4的表達(dá)發(fā)揮抑制HCT116 細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，丙泊酚可通過調(diào)控miR-133a/SOX4表達(dá)抑制結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。該結(jié)果為丙泊酚在結(jié)直腸癌手術(shù)過程中發(fā)揮著積極作用提供新的實驗依據(jù)，也為其有望成為結(jié)直腸癌手術(shù)治療中的理想麻醉藥提供新的參考依據(jù)。