翁繩鳳 李寧 邢俊蓬 張長海 郭威

結核病目前仍然是嚴重危及全球的一個公共衛(wèi)生問題。近十年來，由于艾滋病的流行，移動和流動人口的增加，耐多藥結核桿菌的增多，以及不少國家和地區(qū)對結核病控制的忽視等因素，全球結核病形勢急劇惡化［1］。傳統(tǒng)結核診斷技術不足是造成結核不能有效被控制的原因之一，世界許多地區(qū)結核病診斷仍然依賴不敏感、容易漏診的涂片鏡檢法及耗時長的結核分枝桿菌培養(yǎng)法，從而導致延誤診療［2］。因此亟需新診斷技術來彌補這些方法的不足。近年來，由美國Cepheid 公司研發(fā)生產的新型的分子檢測方法-結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampin，Xpert MTB/RIF），逐步受到國內外的廣泛關注。2010年12月世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）正式推薦使用Xpert MTB/RIF 檢測技術作為一種結核病快速診斷的新方法。該方法操作簡單，快捷，全程檢測只需2 h，而傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)（Lowenstein-Jensen，LJ）需要4～8 周，時間長，無法滿足臨床需求。為了評估該技術結核病診斷效能，本研究通過對242 例臨床診斷為肺結核患者的痰標本分別采用傳統(tǒng)LJ 法和Xpert MTB/RIF 法進行檢測，通過比對檢測的敏感度、特異度探討Xpert MTB/RIF 檢測技術的臨床應用前景。

1 材料與方法

1.1 病例來源

選取本院2016年1月至2017年7月期間住院且臨床已診斷肺結核患者242 例，其中男性182例，女性60 例，年齡范圍18～94 歲，平均（58.45±20.77）歲。病例診斷依據中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS288-2017 肺結核診斷［3］：臨床診斷病例在排除其他肺部疾病基礎上符合以下6 種情況：①胸部影像學有活動性肺結核相符的病變，并具有相應的臨床表現(xiàn)。②胸部影像學有活動性肺結核相符的病變，并獲得任何1 種免疫學檢查結果支持。③胸部影像學有活動性肺結核相符的病變，肺外組織病理檢查證實為結核病變。④胸部影像學有活動性肺結核相符的病變，和支氣管鏡檢查都符合氣管/支氣管結核。⑤符合結核性胸膜炎影像學改變，胸水為滲出液，腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）高，并獲得任何1 種免疫學檢查結果支持。⑥兒童具有肺結核臨床表現(xiàn)，符合結核病影像學改變，并獲得結核菌素試驗或γ-干擾素釋放試驗結果支持。對照組選取排除結核病以外的其他呼吸道疾病患者30 例，其中肺癌8 例，細菌性肺炎10 例，慢性阻塞性肺病9 例，支氣管擴張3 例，疾病診斷標準參照《實用內科學》［4］。

1.2 儀器與試劑

Gene Xpert MTB/RIF 檢測儀及試劑盒購自美國Cepheid 公司；改良羅氏培養(yǎng)基、藥敏培養(yǎng)基及抗酸染液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分離培養(yǎng)和藥敏試驗

采用4%氫氧化鈉處理法，用無菌操作方法將標本接種于改良羅氏培養(yǎng)基的斜面上，37℃，含5%～10% CO2溫箱培養(yǎng)8 周。分別在培養(yǎng)第3 天和第7 天各觀察一次，此后每周觀察一次生長情況并記錄。陽性結果隨時報告。培養(yǎng)56 天后無生長判斷為陰性結果。培養(yǎng)基上一旦出現(xiàn)菌落即進行抗酸染色確認是抗酸桿菌，然后進行菌種鑒定及藥敏。所有操作參照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》［5］進行。藥敏試驗采用羅氏比例法：培養(yǎng)陽性者做藥敏試驗，參照《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》［6］，質控菌株為H37RV，來自北京市結核病防治所。

1.3.2 Xpert MTB/RIF 檢測

每份樣本需收集至少1 mL 痰液，在處理前采集好的痰標本需存放在2℃～8℃。根據《結核病實驗室檢驗規(guī)程》［5］的操作方法進行痰樣本處理。將前處理管在漩渦振蕩器上震蕩20 s 直至無可見塊狀痰標本存在。取2 mL 處理后樣本由加樣孔緩慢加入Cartridge 反應盒內，將反應盒放入Gene Xpert 檢測系統(tǒng)進行檢測，2 h 后系統(tǒng)自動顯示MTB 和RIF 檢測結果。MTB 陽性的診斷標準為5個探針中至少2 個探針Ct 值≤38，并可進一步按照Ct 值對樣本中MTB 進行半定量分析，Ct 值＜16 為髙荷菌量，16～22 為中等荷菌量，22～28 為低荷菌量，＞28 為極低荷菌量［7］。檢測利福平耐藥的基礎在于MTB 特異性分子信標ΔCt 值，系統(tǒng)設置的結果判斷標準為［7］：ΔCt＞3.5 提示對利福平耐藥，ΔCt≤3.5 提示對利福平敏感。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據分析，計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Xpert MTB/RIF 對痰標本MTB 的檢測結果

242 例肺結核患者中，Xpert MTB/RIF 檢測MTB 敏感度為54.96%（133/242），特異度為100%（30/30）。利福平耐藥檢出率為24.06%（32/133）。見表1。

表1 Xpert MTB/RIF 對痰標本MTB 檢測分析［（n，%）］Table 1 Sputum MTB analysis by Xpert MTB/RIF［（n，%）］

2.2 Xpert MTB/RIF 檢測技術與LJ 培養(yǎng)法檢測MTB 結果比對

以臨床診斷為金標準，Xpert MTB/RIF 法陽性率54.96%（133/242），LJ 培養(yǎng)法陽性率40.5%（98/242）。以固體培養(yǎng)為金標準，Xpert MTB/RIF檢測MTB的敏感度為86.73%（85/98），特異度為64.60%（93/144）。2 種方法陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=59.712，P=0.000），2 種方法結果符合率為73.55%（178/242）。對Xpert MTB/RIF 和固體培養(yǎng)進行Kappa 檢驗，K=0.751，兩者具有好的一致性。2 種方法聯(lián)合檢測，總陽性率60.33%（146/242）。見表2。

2.3 Xpert MTB/RIF 檢測技術與LJ 藥敏法檢測利福平耐藥結果分析

表3結果中，Xpert MTB/RIF 檢出利福平耐藥21 例，耐藥率24.71%（21/85）；LJ 法檢出利福平耐藥20 例，耐藥率23.53%（20/85）。2 種方法對利福平耐藥性的檢出率無統(tǒng)計學差異（χ2=0.033，P=0.869）。2 種方法利福平耐藥性檢測符合率為98.82%（84/85）。

表2 Xpert MTB/RIF 與LJ 培養(yǎng)檢測MTB 結果對比分析Table 2 Comparison of Xpert MTB/RIF and LJ culture in detection of MTB

表3 Xpert MTB/RIF 與LJ 藥敏法檢測利福平耐藥性結果對比分析Table 3 Comparison of Xpert MTB/RIF and conventional drug susceptibility on Rifampicin

3 討論

肺結核是通過肺部感染結核分枝桿菌而導致的疾病，大多數(shù)結核菌存在于肺部病灶壞死組織，然后通過痰液將結核菌排除體外。所以，是否從痰液檢出結核菌通常作為依據來診斷患者是否患有結核病。目前傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)法陽性率只有30%～40%［8-11］，特異度差，各種分枝桿菌均可生長，需要結合分枝桿菌菌種鑒定方可確定是否為結核分枝桿菌?？顾崛旧科Y核菌數(shù)目需＞5 000 條/mL 才能得到陽性結果［12］。而Xpert MTB/RIF 檢測技術在痰標本中的檢測極限為131 CFU/mL，靈敏度遠高于涂片檢測［10］并且Xpert 技術具有操作簡便，生物安全性高，檢測過程不易受干擾等特點［13］。

國內報道的對Xpert MTB/RIF 檢測技術的評估，其研究對象大多是成年人或兒童，對老年人群該技術的應用評估報道不多［14］。本實驗在一家三級老年綜合醫(yī)院進行，老年人群有其特殊性，常存在合并多種基礎疾病，結核癥狀不典型，咳痰困難等問題，需要更為敏感的檢測方法早期診斷。本次研究對象是臨床診斷肺結核患者，應用Xpert MTB/RIF 檢測痰液中的MTB 及利福平耐藥性，并與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)方法進行比對來評價它在老年綜合醫(yī)院中肺結核診斷的敏感度和特異度。

近年來國內外對此項技術做了許多研究，針對不同的檢測標本它的敏感性和特異性顯示不同差異。一項多中心研究結果顯示Xpert MTB/RIF診斷結核病的特異度達99.2% ，靈敏度為92.2%，對利福平是否耐藥檢測的正確率約98%［15］。HU等［16］研究顯示痰培養(yǎng)陽性患者中Xpert 的靈敏度為94.5%，特異度為99.8%。趙冰等［17］研究發(fā)現(xiàn)，以臨床診斷為參考標準，痰Xpert 靈敏度為58.82%，特異度為99.68%。本次研究也顯示，在臨床診斷肺結核病例中，它檢測敏感度為54.96%，高于黃建斌［18］和趙冰等［17］研究結果（48.05%和45.45%）。說明Xpert MTB/RIF 檢測技術在檢測不同標本時，敏感度存在差異，但都顯示很高的特異度。但以羅氏培養(yǎng)結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測MTB 的敏感度和特異度明顯低于王怡心等學者［13］的研究，原因可能與痰的質量有關。試驗中大多數(shù)是老年患者，不能正確咳痰，有的標本是口水，嚴重影響檢測結果。所以，對于老年人，一次陰性結果不能排除結核病的可能，多次檢測并引導正確留痰才能提高陽性率。

利福平作為重要抗結核藥物，耐藥現(xiàn)象嚴重，并且對利福平耐藥的90%菌株同時對異煙肼耐藥，因此檢測利福平耐藥性可作為多重耐藥結核桿菌（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）的篩選標志［19］。Boehme 等［15］研究結果顯示，與比例法藥敏試驗結果相比，Xpert MTB/RIF 能夠正確判斷97.6%的利福平耐藥菌株和98.1%的利福平敏感菌株。本研究中2 種方法檢測利福平耐藥性的符合率也達到98.82%。30 例非結核患者Xpert MTB 全部陰性，提示該方法的高特異度，與其他學者［20-21］研究結果（97.5%和98.8%）相似，說明對老年人群也具有高特異性。但本研究未建立與中青年的比對，不能充分說明該技術在老年人群中的檢測特點。另外，2 種方法聯(lián)合檢測結核分枝桿菌提高了單一方法的靈敏度，對結核病早期診斷有更大的意義。

當然Xpert MTB/RIF 也存在些自身的問題及局限性，比如，對痰質量的要求，也不能區(qū)分死菌或活菌，但它作為一種快速、直接可靠、高靈敏度和特異度地檢測結核病患者以及是否對利福平耐藥的新診斷技術，可更快的幫助臨床從病原學上檢出結核病患者，提高確診率。同時該檢測設備僅需要2 個獨立區(qū)域，更多的基層實驗室能達到這種低設施要求，有助于基層結核病患者較早的得到準確的診斷，充分的治療和患者管理［22］。因此，建議在實驗室條件不高的地區(qū)推廣使用。