李君強(qiáng) 蔣茂芬 唐晶晶 王敏 劉春姣 肖維華 馬海芬

肺癌發(fā)病率在世界惡性腫瘤中排名第一，死亡率也位居首位，是一個(gè)嚴(yán)重影響居民健康和生活質(zhì)量的公共衛(wèi)生問題［1］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最為常見類型，所占比例約為80%～85%［2-3］。手術(shù)治療是早期NSCLC 治療的首選有效手段，而治療失敗原因主要原因?yàn)橥砥谵D(zhuǎn)移及惡性程度較高等。曾有國內(nèi)外研究報(bào)道，腫瘤轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素參與的生物學(xué)過程，其中細(xì)胞遷移為腫瘤轉(zhuǎn)移的首要步驟，而細(xì)胞肌動蛋白骨架重構(gòu)是細(xì)胞運(yùn)動的第一步，故認(rèn)為肌動蛋白的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有著一定的聯(lián)系［4-5］。LASP-1 蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的肌動蛋白結(jié)合蛋白和斑粘連結(jié)合蛋白支架蛋白，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有著密不可分的關(guān)系［6］。曾有研究報(bào)道，LASP-1cDNA 最早由乳腺癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的cDNA 文庫中篩選克隆而得到［7］。而在近年研究報(bào)道中證實(shí)，LASP-1cDNA 在肝癌、食管鱗癌、腎透明細(xì)胞癌、胃癌及膽囊癌組織中表達(dá)異常較為多見，關(guān)于其在NSCLC 中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚未明確［8］。本文旨在探討LASP-1 蛋白在NSCLC 癌組織中的表達(dá)及與其臨床病理特征的相關(guān)性，分析LASP-1 蛋白在NSCLC 發(fā)生和進(jìn)展中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

隨機(jī)選取2014年1月至2018年5月在本院就診的102 例NSCLC 患者作為研究對象，其中男61例，女41 例，年齡為48～80 歲，平均年齡為（58.36±5.64）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合臨床上NSCLC 明確診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；②所有患者完善準(zhǔn)備后均行手術(shù)治療且術(shù)中及術(shù)后均行病理學(xué)檢查確診；③所有患者知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在手術(shù)禁忌癥者；②除NSCLC外存在其他惡性腫瘤者；③存在原發(fā)性肝腎、功能障礙者；④臨床病例資料不完整或缺乏準(zhǔn)確性者。

1.2 研究方法

收取102 例NSCLC 患者中肺鱗狀細(xì)胞癌與腺癌組織共102 份（觀察組），另收集肺癌旁組織形態(tài)學(xué)正常的肺組織（距離腫瘤5 cm 以上）102 份（對照組），2 組組織標(biāo)本均采用免疫組化EnVision 法進(jìn)行LASP1 蛋白水平的檢測。

1.2.1 檢測所需試劑/儀器

免疫組化試劑盒（H.SABC，SAl082）購于武漢博士德生物工程有限公司；自動切片機(jī)購自德國LECIA 公司；顯微攝像儀（BX60 型）購自日本Olympus 公司；Simply P 總RNA 提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；RT-PCR 試劑盒（批號AK2801）購自于日本TaKaRa 公司；熒光定量PCR儀（PRISM7700）購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司；LASP-1 一抗體購自上?；鄯f科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）由本醫(yī)院提供，山羊抗兔/鼠二抗購自上海睿鉑賽生物科技有限公司。

1.3 免疫組化檢測方法

采用Envision 法檢測：所有標(biāo)本組織石蠟切片厚度為4 μm，裱片后60℃烘烤2～4 h；二甲苯2 次及酒精梯度脫蠟至水；置切片于1.5%甲醇過氧化氫液（室溫10 min）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，將切片取出用自來水沖洗干凈，置切片于pH 值為9.0的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)（煮沸20 min，室溫冷卻20 min）；將切片用自來水清洗干凈，依次入蒸餾水1 次、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）3 次；將切片放于孵育盒上滴加正常非免疫山羊血清；將血清清除后，滴加1∶600 濃度的LASP-1 一抗（來源于英國Abcam 公司）4℃孵育過夜，對照組采用PBS 代替一抗；次日取出切片置于自來水、蒸餾水1 次、PBS 3 次清洗切片；滴加山羊抗兔/鼠二抗（DAKO）室溫孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，最后中性樹脂封片。

1.4 資料收集與染色結(jié)果判讀

記錄所有患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、分化程度、浸潤深度、TNM 分期系統(tǒng)（tumor node metastasis，TNM）分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和不同組織標(biāo)本中LASP-1 蛋白的表達(dá)水平，并比較不同組織中LASP-1 蛋白表達(dá)水平的差異。LASP-1 蛋白結(jié)果評定方法［10］：每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10 個(gè)高倍視野（×100）的陽性細(xì)胞百分比計(jì)算，以其平均值作為評定依據(jù)。陽性染色為淡黃色、棕褐色或棕黃色，呈團(tuán)塊狀或顆粒狀。專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評分［11］：3 分為棕褐色，2 分為棕黃色，1 分為淺黃色；0 分為無色；根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例評分：全陰性為0 分，陽性細(xì)胞＞75%為4 分，51%～75%為3 分，11%～50%為2 分，≤10%為1分。二者評分的乘積≥2 分者則判斷為LASP1 蛋白陽性，二者評分的乘積＜2 分者為陰性。將已知陽性切片作為陽性對照。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

均采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料通過率或構(gòu)成比表示，并采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組組織標(biāo)本中LASP-1 蛋白表達(dá)情況比較

NSCLC 患者癌組織中LASP-1 蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1；且LASP-1 蛋白在NSCLC 癌旁正常組織細(xì)胞漿中表現(xiàn)為無色，而在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌癌組織細(xì)胞器細(xì)胞漿中表現(xiàn)為棕褐色，見圖1A～C。

表1 2 組組織標(biāo)本中LASP-1 蛋白表達(dá)情況比較Table 1 Comparison of LASP-1 protein expression in tissue samples from the 2 groups

圖1 LASP-1 蛋白在不同組織中的表達(dá)情況Figure 1 Expression of LASP-1 protein in different tissues

2.2 不同臨床病理特征的NSCLC 患者其LASP-1蛋白表達(dá)情況比較

不同性別、年齡、腫瘤大小和病理類型的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白陽性表達(dá)率無差異（P＞0.05），但腫瘤低分化、TNM 分期Ⅲ期+Ⅳ期，浸潤深度T3+T4、以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者其LASP-1 蛋白的陽性表達(dá)率顯著較高（P＜0.05），見表2。

3 討論

目前臨床上對于NSCLC 的治療主要以手術(shù)為主，但分析大量病例資料可知同樣病理類型和分期的NSCLC 患者予以相同標(biāo)準(zhǔn)化治療后，其預(yù)后效果仍存在著一定的差異。有研究顯示不同病理類型的預(yù)后差異可能與腫瘤病灶的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］。根據(jù)既往文獻(xiàn)的報(bào)道，細(xì)胞中的LASP-1蛋白主要定位在胞漿［13］。但也有研究報(bào)道LASP-1 可存在于胞核中［14］。本研究結(jié)果中，LASP-1 蛋白主要存在于細(xì)胞漿中，與既往研究結(jié)果一致［15］。曾有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤的TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為影響NSCLC 患者遠(yuǎn)期預(yù)后生存的主要因素［16］。而臨床分期仍舊為目前臨床上NSCLC診治的主要依據(jù)［17］，故及時(shí)明確腫瘤病灶是否侵襲和轉(zhuǎn)移是評估患者預(yù)后的重要手段。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織中LASP-1蛋白陽性率表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，可提示，LASP-1 蛋白與NSCLC 的發(fā)生可能有著一定的聯(lián)系。另一方面，本組數(shù)據(jù)顯示，不同性別、年齡、腫瘤大小和病理類型的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白陽性率的表達(dá)無明顯差異，但腫瘤低分化、TNM 分期Ⅲ期+Ⅳ期，浸潤深度T3+T4、以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白的陽性表達(dá)率均顯著升高。進(jìn)一步表明，LASP-1 蛋白的表達(dá)水平與NSCLC 的惡性程度、分期以及病灶的侵襲、轉(zhuǎn)移等均有著密不可分的關(guān)系。結(jié)合以往生物學(xué)研究可知，LASP-1 基因染色體定位于17q11-q21.3［18］。LASP-1 蛋白中的SH3 和LIM 結(jié)構(gòu)域均在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起著極為重要的作用，。其中SH3 結(jié)構(gòu)領(lǐng)域可與palladin 蛋白、脂肪瘤多見融合伴侶、前白介素-16 和血管擴(kuò)張刺激磷蛋白和斑聯(lián)蛋白等進(jìn)行相互結(jié)合，從而起到一定的作用。曾有不少國內(nèi)外研究報(bào)道，LASP-1 蛋白在機(jī)體組織中可通過SH3 結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞偽足形成、延伸和侵襲起著一定的促進(jìn)作用［19］。故對于分化程度越低，浸潤程度越深以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其LASP-1 蛋白表達(dá)更高。而Krp1 蛋白是一種涉及偽足延伸和細(xì)胞運(yùn)動粘著斑蛋白。相關(guān)研究顯示，中的LIM 結(jié)構(gòu)域可與Krp1 蛋白相互作用，故在NSCLC 癌組織中，LASP-1 蛋白表達(dá)的升高可促使LIM 結(jié)構(gòu)域與LASP-1 結(jié)合共同定位于膜聯(lián)整合素CD44 和銜接蛋白Ezrin［20］。CD44與Ezrin 蛋白均介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)接觸，參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖生長。近年來，隨著病理學(xué)研究的不斷深入，有研究報(bào)道顯示，LASP-1 蛋白與口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移能力有關(guān)，參與了腫瘤的進(jìn)展和侵襲過程［21］。對肝癌、食管鱗癌、腎透明細(xì)胞癌、胃癌及膽囊癌研究亦發(fā)現(xiàn)LASP-1 蛋白高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和浸潤能力［22］。而本組數(shù)據(jù)結(jié)果也表明，腫瘤分化越低、分期越高以及出現(xiàn)周圍組織浸潤轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白表達(dá)水平更高。由此可見，LASP-1 蛋白與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖生長有著一定的聯(lián)系。

表2 不同臨床病理特征的NSCLC 患者其LASP-1 蛋白表達(dá)情況比較［（n，%）］Table 2 Comparison of LASP-1 protein expression in NSCLC patients with different clinicopathological features［（n，%）］

綜上所述，LASP-1 蛋白在NSCLC 患者癌組織中表達(dá)水平較高，且與腫瘤分化程度、TNM 分期、浸潤深度和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。因此，LASP-1 蛋白表達(dá)水平的增加可能參與促進(jìn)NSCLC 腫瘤病灶的侵襲和轉(zhuǎn)移。