孔明圣，于洋，張亞倩，李玲，張文峰，邵紅偉

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

在有關(guān)基因功能的研究中將目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞的效率高低對研究結(jié)果至關(guān)重要，電穿孔是基因傳輸常用的方法之一，相對于病毒傳輸系統(tǒng)和其他轉(zhuǎn)染方法，電穿孔具有方便高效，不引入額外的轉(zhuǎn)染介質(zhì)，潛在副作用更低，適合各類細(xì)胞系，原代細(xì)胞和干細(xì)胞，包括一些常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并且已廣泛用于體外和體內(nèi)各種應(yīng)用，包括基因治療，傷口愈合和藥物篩選等[1-4]。

隨著嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(CAR-T)、T細(xì)胞抗原受體(T Cell Receptor, TCR)修飾T細(xì)胞(TCR-T)等基于免疫細(xì)胞的抗腫瘤研究以及基于免疫細(xì)胞基因組編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，目前對于T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的基因修飾研究越來越多[5-8]。而作為原代細(xì)胞，免疫細(xì)胞尤其是淋巴細(xì)胞的基因傳輸效率一直是制約相關(guān)研究的重要因素。本研究通過摸索各種可能會導(dǎo)致電穿孔轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的因素，對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人PBMC的電穿孔方法進(jìn)行了較為詳細(xì)的分析與探索，為基于淋巴細(xì)胞的相關(guān)基礎(chǔ)研究以及臨床應(yīng)用提供了有益的參考。本研究分析了電穿孔電壓、脈沖時間、電轉(zhuǎn)緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)，質(zhì)粒質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

質(zhì)粒pCMV-GFP(日本NEPA GENE，4 700 bp)；質(zhì)粒pDC315-GFP(本實驗室構(gòu)建，4 700 bp)；質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP(本實驗室構(gòu)建，7 200 bp)；質(zhì)粒pMax-E2F1(3 500 bp)、pEB-3xflag-GFP(8 300 bp)、px458_2A_GFP(9 300 bp)均購自Addgene；人外周血(來自本實驗室志愿者)；DMEM培養(yǎng)基、Fetal Bovine Serum、PBS pH7.2 basic(1×)、Opti-MEM、Penicillin streptomycin、RPMI-1640培養(yǎng)基、X-VIVO無血清培養(yǎng)基均購自GIBCO；QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit(25)(QIAGEN)；Toxin SensorTM內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)(金斯瑞生物科技)。

1.2 主要儀器

NEPA21 高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(日本NEPA GENE)；OLYMPUS IX51倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯)； NANODROP 2000超微量分光光度計(Gene Company Limited)；GALLIOSTM流式細(xì)胞分析儀(BECKMAN COULTER)；VARIOSKAN FLASH全波長光譜掃描儀(THERMO SCIENTIFIC)；JS-680D全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)；JS-2012細(xì)胞培養(yǎng)箱(THERMO SCIENTIFIC)。

1.3 方法

1.3.1 PBMC的制備 利用真空采血管抽取本實驗室志愿者30 mL左右靜脈血，使用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC。PBMC的活化培養(yǎng)：第1天，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1～2×106/mL，加入重組人IFN-γ(1 000 U/mL)；第2天，加入OKT-3(50 ng/mL)和重組人IL-2(300 U/mL)；第3天細(xì)胞換液，補(bǔ)充重組人IL-2(300 U/mL)；之后根據(jù)細(xì)胞密度每3天半量換液或細(xì)胞傳代1次，并補(bǔ)加重組人IL-2(300 U/mL)。

1.3.2 Nanodrop2000測定質(zhì)粒濃度 按照Nanodrop 2000儀器測量范圍(2～15 000 ng/μL)，將高濃度抽提質(zhì)粒用超純水稀釋至40～50 ng/μL(電泳圖計算值)，每次取1 μL測量，每個樣品測3次，取平均值。

1.3.3 全波長光譜掃描測定質(zhì)粒純度 將質(zhì)粒用超純水稀釋至約50 ng/μL，取100 μL稀釋后質(zhì)粒加入到96孔微孔板中，設(shè)置掃描區(qū)間為200～400 nm進(jìn)行1 nm步進(jìn)的光譜掃描。

1.3.4 質(zhì)粒的內(nèi)毒素含量測定 將質(zhì)粒稀釋至約5 ng/μL，使用Toxin SensorTM內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)對質(zhì)粒的內(nèi)毒素含量進(jìn)行測定，詳細(xì)檢測方法見試劑盒說明書，檢測范圍為0.01～1 EU/mL。

1.3.5 質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染條件的設(shè)置 將PBMC用生理鹽水洗滌后計數(shù)，再用電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌1遍后調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL，加入質(zhì)粒10 μg/組。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果以及廠家推薦電轉(zhuǎn)的電壓和脈沖時間參數(shù)，按照表1共設(shè)置了8組電穿孔條件，對未經(jīng)培養(yǎng)刺激的PBMC進(jìn)行電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染前，提前加入1 mL含 IL-2(300 U/mL)的X-VIVO無血清培養(yǎng)基于24孔板中，將孔板置于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育15 min，電轉(zhuǎn)完成后盡快將細(xì)胞吸回培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%(φ)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.6 PI染色及流式檢測 將10×Annexin-binding buffer 用超純水稀釋10倍，將細(xì)胞懸液收集到1.5 mL EP管中，離心去上清，加入100 μL/組稀釋好的1×Annexin-binding buffer，吹打均勻后加入5 μL /組PI染色劑，避光孵育15 min。加入500 μL 1×Annexin-binding buffer后，轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)檢測。

表1 電穿孔條件Table 1 Electroporation conditions

注：+.根據(jù)推薦參數(shù)設(shè)置的測試組； -.未測試。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。為解決多組數(shù)據(jù)兩兩之間相似性強(qiáng)弱關(guān)系，采用Pearson相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)r大于絕對值0.8為極強(qiáng)相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 電壓與脈沖時間的優(yōu)化

首先對電壓和脈沖時間進(jìn)行了摸索(圖1)。根據(jù)廠家推薦方案，設(shè)置細(xì)胞密度為2×107/mL。質(zhì)粒為NEPA公司提供的陽性質(zhì)粒pCMV-GFP(4 700 bp)，用量為10 μg/組，電轉(zhuǎn)緩沖液為Opti-MEM。按照設(shè)計的電壓和脈沖時間分別進(jìn)行電擊，轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行熒光拍照和流式分析。從圖1A中可以看出，在脈沖時間設(shè)定為5 ms的前提下，從150～225 V中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率隨著電壓增加而增加，至275 V后轉(zhuǎn)染效率明顯下降。細(xì)胞凋亡率則是一直隨著電壓增加而增加。電壓在達(dá)到275 V后，由于細(xì)胞凋亡率的增加，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)染效率的快速下降。圖1B中可以看出，在電壓設(shè)定為200 V的條件下，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率在0.5～3 ms區(qū)間水平較低，檢測不到熒光表達(dá)，而至5 ms，轉(zhuǎn)染效率明顯提高。細(xì)胞凋亡率在脈沖時間為0.5～3 ms之間是隨著時間增加而增加的，而到了5 ms的時候，凋亡率反而比3 ms更低。說明尋找一個凋亡率較低同時轉(zhuǎn)染效率較高的脈沖時間是可行的。綜合考慮轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞凋亡率，在保證更好的細(xì)胞狀態(tài)下，選擇200 V，5 ms作為后續(xù)實驗的電擊方案。

2.2 緩沖液對電穿孔效率的影響

比較了PBS，RPMI-1640和Opti-MEM 3種不同的緩沖液對電穿孔效率的影響(圖2)，可以看出，在轉(zhuǎn)染效率上Opti-MEM>RPMI-1640>PBS；在細(xì)胞存活率上，Opti-MEM與1640比較接近，但兩者都顯著優(yōu)于PBS組。PBS組細(xì)胞狀態(tài)極差，轉(zhuǎn)染熒光效率也極低，說明適合的電轉(zhuǎn)緩沖液對電穿孔是非常重要。

A.比較150～275 V范圍電壓對電轉(zhuǎn)PBMC的影響； B.比較0.5～5 ms范圍脈沖時間對電轉(zhuǎn)PBMC的影響。

圖1不同的電壓和脈沖時間對人PBMC轉(zhuǎn)染效率以及凋亡率的影響

Figure1Effect of different voltages and pulse times on human PBMC transfection efficiency and apoptotic rate

2.3 細(xì)胞狀態(tài)對電穿孔效率的影響

由于細(xì)胞的不同生理狀態(tài)能夠顯著影響轉(zhuǎn)染效率，對活化和靜息狀態(tài)的PBMC分別進(jìn)行了電穿孔轉(zhuǎn)染實驗。從圖3可以看出，不同的細(xì)胞狀態(tài)下電穿孔的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞凋亡率有顯著區(qū)別?；罨囵B(yǎng)7 d后，細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，其轉(zhuǎn)染效率與靜息狀態(tài)的PBMC相比有明顯增加，不過隨之而來的是細(xì)胞凋亡率也顯著增加。

2.4 質(zhì)粒因素對電穿孔效率的影響

2.4.1 質(zhì)粒的分子量對電穿孔效率的影響

為了比較不同分子量大小的質(zhì)粒對PBMC電穿孔轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞凋亡率的影響，選擇了5種攜帶GFP標(biāo)記的常用質(zhì)粒，分別是px458_2A_GFP(9 300 bp)、pEB-3xflag-GFP(8 300 bp)、pcDNA3.1-GFP(7 200 bp)、pCMV-GFP(4 700 bp)、pMax-E2F1(3 500 bp)(圖4)。對于PBMC電穿孔結(jié)果，只有觀測到分子量比較小的pMax-E2F1組和pCMV-GFP組有熒光，前者的熒光率顯著高于后者；而當(dāng)質(zhì)粒大小≥7 200 bp后并沒有觀測到熒光；從圖中也可以看出質(zhì)粒越大，細(xì)胞的凋亡率也隨之增大，表明質(zhì)粒大小會顯著影響電穿孔的效率，同時質(zhì)粒自身的性質(zhì)也會影響熒光率。

A. PBS緩沖液組； B. 1640 組； C. Opti-mem組。

圖2不同緩沖液對PBMC電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞凋亡的影響
Figure2Effect of different buffers on PBMC electroporation efficiency and apoptosis

A.新鮮分離的未活化PBMC組； B.經(jīng)細(xì)胞因子刺激PBMC組。

圖3不同的細(xì)胞狀態(tài)對電轉(zhuǎn)效率和細(xì)胞凋亡率的影響
Figure3Effect of different cell states on electrotransfer efficiency and apoptotic rate

A. px458_2A_GFP(9 300 bp); B. pEB-3xflag-GFP(8 300 bp); C. pcDNA3.1-GFP(7 200 bp); D. pCMV-GFP(4 700 bp);E. pMax-E2F1(3 500 bp)。

圖4質(zhì)粒的分子量對電穿孔效率的影響
Figure4Effect of the molecular weight of plasmid on electroporation efficiency

2.4.2 質(zhì)粒的純度對電穿孔效率的影響

從圖5的A和B中可以看出，不同方法提取的質(zhì)粒其不同構(gòu)象分子所占的比例差異較大，利用Nanodrop 2000檢測各質(zhì)粒的濃度，結(jié)果顯示個別質(zhì)粒所測濃度與根據(jù)電泳圖灰度值所估算的濃度差異較大(表2)，與之相對應(yīng)的260/230比值也偏小。從這一結(jié)果推測可能其中含有雜質(zhì)，利用Nanodrop 2000對各質(zhì)粒進(jìn)行全波長掃描，可以看出每組質(zhì)粒吸收峰圖無顯著區(qū)別(圖5C)。隨后利用全波長酶標(biāo)儀對質(zhì)粒進(jìn)行光譜掃描分析(圖5D)，可以看出各組質(zhì)粒在200～220 nm之間的吸收光譜圖存在較大差異，3號質(zhì)粒在此處的波動變化最大，顯示存在較多的短波長光吸收雜質(zhì)，且在260～280nm之間的峰型也比較粗糙，顯示雜質(zhì)種類較多，這也在一定程度上解釋了利用不同方法估算出的該質(zhì)粒的濃度差異較大的原因。此外還對各組質(zhì)粒的內(nèi)毒素含量進(jìn)行了測定(圖5E)，可以看出不同方法提取的質(zhì)粒在內(nèi)毒素含量上也存在較大差異。為了探討不同方法所提質(zhì)粒對PBMC電穿孔效率的影響(圖5F)，利用上述優(yōu)化的電壓和脈沖時間對PBMC進(jìn)行了電穿孔轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，從圖中可以看出，只有1號質(zhì)粒有明顯的轉(zhuǎn)染熒光，且細(xì)胞的存活率也是比較高的說明質(zhì)粒純度對于電穿孔轉(zhuǎn)染效率和電轉(zhuǎn)細(xì)胞的存活尤為重要。

A.質(zhì)粒電泳圖(M:1 kb DNA Marker)； B.質(zhì)粒超螺旋比例； C. Nanodrop2000超微量分光光度計質(zhì)粒DNA檢測峰圖； D.全波長酶標(biāo)儀光譜掃描； E.質(zhì)粒內(nèi)毒素含量檢測； F.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PBMC細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞凋亡率分析。

1. qiagen-pCMV-GFP； 2.國產(chǎn)試劑盒-pCMV-GFP； 3.傳統(tǒng)堿裂解法-pCMV-GFP； 4.qiagen-pDC315-GFP； 5.國產(chǎn)試劑盒-pDC315-GFP。

圖5質(zhì)粒的純度檢測以及不同純度質(zhì)粒對電穿孔效率的影響
Figure5Detection of plasmid purity and effect of plasmid on electroporation

為了更好地顯示各組質(zhì)粒在電穿孔轉(zhuǎn)染方面的差異，以HEK-293細(xì)胞作為對照組進(jìn)行了轉(zhuǎn)染實驗(圖6)。從圖中可以看出1～5號質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率分別為52%，26.5%，20.3%，22.6%，4.3%。1號和4號存活率都在65%以上，而2、3、5號組的存活率都在43%以下。

為了更好地挖掘影響電穿孔效率的信息，對所有質(zhì)粒純度相關(guān)指標(biāo)和轉(zhuǎn)染情況進(jìn)行量化，包括以下變量：質(zhì)粒超螺旋比例、質(zhì)粒Nanodrop檢測濃度值、內(nèi)毒素含量、細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞凋亡率，使用SPSS統(tǒng)計學(xué)分析軟件，對各個變量之間進(jìn)行相關(guān)性分析以及其相關(guān)性的顯著性檢驗(表3)。發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素含量與細(xì)胞轉(zhuǎn)染率、細(xì)胞凋亡率具有極強(qiáng)相關(guān)性(r>0.83)。

表2質(zhì)粒的電泳灰度值濃度和Nanodrop2000儀器檢測分析

Table2Multivariate two-way correlation analysis of plasmid factor influencing electrical transition

注：260/280、260/230為儀器檢測質(zhì)粒純度的相關(guān)指標(biāo)。

1. qiagen-pCMV-GFP； 2.國產(chǎn)試劑盒-pCMV-GFP； 3.傳統(tǒng)堿裂解法-pCMV-GFP； 4. qiagen-pDC315-GFP； 5.國產(chǎn)試劑盒-pDC315-GFP。

圖6質(zhì)粒純度對293細(xì)胞系電穿孔效率和細(xì)胞活性的影響
Figure6Effect of plasmid purity on electroporation of 293 cell line in control group and transfection analysis

表3質(zhì)粒因素對電轉(zhuǎn)影響多因素兩兩相關(guān)性分析

Table3Correlation analysis of the influence of plasmid factors on electrotransformation

項目r項目r項目rA :B0.313B :D0.530C :G0.739A :C0.401B :E0.088D :E0.729A :D0.265B :F0.586D :F0.871?A :E0.423B :G0.096D :G0.572A :F0.139C :D0.926?E :F0.736A :G0.091C :E0.930?E :G0.861?B :C0.200C :F0.831?F :G0.816?

注：A. Nanodrop2000質(zhì)粒濃度值; B.質(zhì)粒超螺旋比例; C.內(nèi)毒素含量; D. PBMC轉(zhuǎn)染效率; E. PBMC凋亡率; F. HEK-293轉(zhuǎn)染效率; G. HEK-293凋亡率;*P<0.05

3 討論

在非病毒傳輸系統(tǒng)中，能夠有效地對淋巴細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的方法當(dāng)首推電穿孔技術(shù)，在樣品制備、實驗周期、便捷程度等方面，電穿孔都具有顯著的優(yōu)勢。然而，諸多的因素，如電壓、電擊時間、細(xì)胞狀態(tài)、電轉(zhuǎn)緩沖液、質(zhì)粒的純度、大小等都會影響到電穿孔的轉(zhuǎn)染效率，這極大限制了電穿孔轉(zhuǎn)染的應(yīng)用[9]。原代淋巴細(xì)胞的非病毒方法轉(zhuǎn)染一直是難點之一，對其進(jìn)行優(yōu)化對于推動和簡化基因相關(guān)的免疫學(xué)功能研究非常重要。目前利用電穿孔法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染人PBMC的報道較少[10-13]。本研究中，首先對PBMC電穿孔的電壓和脈沖時間進(jìn)行了優(yōu)化，可以看出隨著電壓的增大，細(xì)胞凋亡率會隨之增大，而轉(zhuǎn)染效率在一定范圍內(nèi)隨之增大，超過一定范圍反而降低。之前有研究表明，適當(dāng)?shù)碾妷汉兔}沖時間可以保證細(xì)胞在電轉(zhuǎn)后盡快地……恢復(fù)，而過大的電壓則會導(dǎo)致細(xì)胞的不可逆電穿孔[14-15]。

本研究考察了不同電轉(zhuǎn)緩沖液對電穿孔效率的影響，其中Opti-MEM的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率較高。有關(guān)電穿孔緩沖液中細(xì)胞致敏動力學(xué)的研究表明,不同緩沖液對細(xì)胞大小形態(tài)的變化，細(xì)胞骨架破壞程度和鈣流入以及細(xì)胞活性的恢復(fù)都有重要的影響，因此對每種細(xì)胞，確定最適的電轉(zhuǎn)緩沖液是非常重要的[16-17]。

本研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的純度和性質(zhì)對于電穿孔轉(zhuǎn)染成功與否至關(guān)重要的?？紤]到電穿孔實驗的各種試劑和耗材都可以方便地購買，而自行構(gòu)建的質(zhì)粒其所用的提取方法每個實驗室都不太一樣，即使是相同的提取方法，不同的提取批次也會有差異。通過電泳、微量紫外分光檢測、全波長酶標(biāo)儀光譜掃描、內(nèi)毒素檢測等多個方面對質(zhì)粒進(jìn)行評價，以確定重要的影響因素。許多研究者會發(fā)現(xiàn)，盡管經(jīng)過仔細(xì)的純化和質(zhì)量控制，仍然很難重復(fù)電轉(zhuǎn)儀公司所標(biāo)示的基因轉(zhuǎn)染效率，這很可能是由于他們使用自行構(gòu)建的更大的質(zhì)粒而不是公司提供的參考質(zhì)粒造成的[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)不同的質(zhì)粒其自身性質(zhì)也會對細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況造成很大差異，尤其是分子量，大分子的DNA轉(zhuǎn)染效率極低，迄今尚無好的解決辦法[9,20]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)除了對質(zhì)粒中內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)等特定的雜質(zhì)進(jìn)行檢測外，利用高分辨率全波長光譜掃描儀對質(zhì)粒進(jìn)行全面的檢測也是有必要的，可以方便快捷地判斷質(zhì)粒的純度。

綜上所述，本研究對影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PBMC電穿孔效率的多種因素進(jìn)行了探索，優(yōu)化了電壓、脈沖時間、電穿緩沖液、細(xì)胞狀態(tài)，闡明了質(zhì)粒純度對電穿孔轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要，為基于淋巴細(xì)胞的基因傳輸相關(guān)研究以及今后的臨床應(yīng)用研究提供了有益的參考。