古展輝，郭姣

(廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心,廣東藥科大學，廣東 廣州 510006)

隨著飲食條件改善，2型糖尿病已是高發(fā)、高危害、嚴重威脅人類健康的疾病。2016年，世界衛(wèi)生組織全球糖尿病報告稱糖尿病病人數(shù)量從1980年的1.08億增加到2014年的4.22億，低收入和中等收入國家的糖尿病患病率上升速度更快[1]。調(diào)查報告顯示，我國糖尿病人群以2型糖尿病為主，占糖尿病患者總數(shù)的90%以上[2]。2017年，中國疾病預(yù)防控制中心慢病中心與北京大學公共衛(wèi)生學院合作在JAMA上發(fā)表了我國糖尿病前期及糖尿病最新流行病學數(shù)據(jù)顯示：糖尿病前期的比例為35.7%，成人糖尿病患病率為10.9%，在相同BMI國際標準分層水平亞洲人群中中國人患糖尿病的風險更高[3]。研究開發(fā)2型糖尿病防治新藥極其重要，合適的2型糖尿病的動物模型則是其防治新藥研發(fā)的必備工具。

2019年Abramson等[4]發(fā)表的論文報道了一種以胰島素作為模型藥物的口服大分子自導(dǎo)向系統(tǒng)，其中應(yīng)用了大鼠進行急性和亞慢性毒性實驗，體外豬胃和禁食豬模擬人體服藥過程進行藥動學實驗，結(jié)果表明該系統(tǒng)提供的血漿中藥物活性成分水平與皮下給藥后的相當，具有替代皮下注射胰島素治療的潛力，為其他生物大分子的口服給藥提供了可能。

嚙齒類動物是生物醫(yī)學研究中最常用的動物，擁有飼養(yǎng)成本低、倫理接受度高、繁殖能力強、轉(zhuǎn)基因技術(shù)完善和可供參考的標準化方案多等優(yōu)勢。雖然嚙齒動物模型的研究常常有助于發(fā)現(xiàn)通路和檢驗假說，但嚙齒類動物和靈長類動物之間在代謝生理學方面存在較大差異[5]，在臨床藥效評價和安全性評價等轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究領(lǐng)域存在局限，為更好開展糖尿病的防治研究和相關(guān)藥物的藥效評價，采用生理病理特征與人更為相近的實驗動物進行研究尤為重要[6]。

非人靈長類動物在嚙齒類動物模型的基礎(chǔ)研究和人類臨床研究之間起著關(guān)鍵的轉(zhuǎn)譯橋梁的作用，非人靈長類動物不僅在基因水平上和人類極為相似，如人類和恒河猴的基因組相似度約為93%，而且在代謝性疾病中的易感性相似，作為一種臨床前動物模型,在研究人體代謝生理病理生理學方面的應(yīng)用可以更加確定藥物對人類的安全性和有效性；但其局限是在可供研究的動物數(shù)量有限、研究費用較高、實驗技術(shù)與設(shè)備普及程度較低、還可能會面臨倫理問題等[7]。

小型豬與嚙齒類動物相比，在生理病理特征上與人更為相似，由于豬與人在基因序列及染色體結(jié)構(gòu)上同源性很高，同時小型豬在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚結(jié)構(gòu)、糖代謝、脂代謝和生理生化指標與人類極為相似；與非人靈長類相比，小型豬容易獲得、研究費用較低、倫理接受度高等，所以是特別適用于2型糖尿病病理機制研究和藥物藥效評價的實驗動物。嚙齒動物、小型豬和非人靈長類動物糖尿病模型優(yōu)劣勢對比見圖1。近年來國內(nèi)外有關(guān)實驗小型豬2型糖尿病模型構(gòu)建的方法及特點介紹如下。

圖1嚙齒動物、小型豬和非人靈長類動物糖尿病模型優(yōu)劣勢對比

Figure1Comparison of advantages and disadvantages of rodent,miniature pig and non-human primate diabetes models

1 糖尿病實驗小型豬的品種

20世紀40年代國外就已開始進行實驗小型豬的開發(fā)研究工作。國外實驗小型豬主要品系為德國哥廷根系(Gottingen)，美國尤卡坦系(Yucatan)和漢福德系(Hanford)等。我國實驗小型豬的開發(fā)研究從20世紀80年代才開始，目前國內(nèi)已實驗化的小型豬品系主要有版納微型豬近交系、廣西巴馬小型豬、貴州小型豬、五指山小型豬近交系和西藏小型豬、蕨麻小型豬等。不同品系在不同的生命科學研究領(lǐng)域有各自的生物學優(yōu)勢與特長。見表1。

為能更好地開展疾病模型的相關(guān)科研工作，應(yīng)充分考慮并利用好各種品系小型豬的上述生物學特點。

2 實驗小型豬2型糖尿病模型制備的方法

高糖高脂飲食(HSHFD)可誘發(fā)小型豬出現(xiàn)典型肥胖，發(fā)生糖耐受降低和胰島素抵抗綜合征，從而建立2型糖尿病模型(見表2)；化學藥物如鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan，ALX)能選擇性的破壞胰島β細胞，使胰島素分泌量下降和血糖(Glucose，Glu)的水平升高，結(jié)合高糖高脂飲食促使小型豬產(chǎn)生2型糖尿病典型“三多一少”的癥狀(見圖2)。劉汝文等[17]報道在制備糖尿病模型時未去勢的小型豬成功率偏低，建立心梗模型時易室顫且心率和血壓比去勢豬更快和更高，提出用小型豬做營養(yǎng)代謝性疾病實驗研究時建議使用去勢豬更有利，且提早把豬去勢便于保定操作和模型建立。

2.1 單純高糖高脂飲食誘導(dǎo)

Low等[18]高糖高脂飲食喂養(yǎng)尤卡坦小型豬6個月發(fā)現(xiàn)小型豬出現(xiàn)肥胖、血脂異常和胰島素抵抗并且系統(tǒng)性胰島素抵抗的發(fā)生伴有血管功能障礙和動脈壁胰島素信號異常。

Yan等[19]從健康巴馬小型豬中根據(jù)空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)和60 min 靜脈糖耐量試驗(IVGTT)的實驗數(shù)據(jù)分為2型糖尿病易感組和2型糖尿病耐受組，兩組同時高糖高脂飲食飼養(yǎng)，結(jié)果表明易感組小型豬的各項生理指標均較耐受組小型豬更接近2型糖尿病癥狀，因此在單純高糖高脂飲食誘導(dǎo)2型糖尿病時可考慮選擇易感2型糖尿病的小型豬作為造模動物。

Liu等[20]將巴馬小型豬隨機分為對照組和高糖高脂組，6個月后，與對照組相比，高糖高脂組穩(wěn)態(tài)模型評價胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)上升2.9倍，小型豬骨骼肌谷氨酸的表達下降，胰島素敏感性下降24.8% 。

景國強等[21]認為高糖高脂飼養(yǎng)6個月能引起較為理想的2型糖尿病小型豬模型，具體表現(xiàn)為體質(zhì)量增加，血糖升高，并出現(xiàn)血清TG、TC水平升高，GLP-1水平顯著下降。

表1 各品系小型豬在生命科學研究中應(yīng)用的特點[8-16]Table 1 Application characteristics of miniature pigs in life science research

表2高脂飼料配方對血液生理生化指標的影響[19-25]

Table1Effect of high-fat feed formula on blood physiological and biochemical indicators

成分百分比/%c(FPG)/(mmol·L-1)c(TG)/(mmol·L-1)c(TC)/(mmol·L-1)油脂5.04.43～8.130.55～1.072.41～4.7310.04.36～10.520.48～2.422.42～20.45蔗糖35.04.71～8.130.50～1.262.42～4.2037.04.70～12.520.54～2.423.00～20.45膽固醇0.04.70～8.500.56～1.262.42～5.002.08.02～12.521.78～2.4217.62～23.28

圖2小型豬2型糖尿病模型不同造模方法的外形特點

Figure2Shape characteristics of miniature pig models of type 2 diabetes mellitus

Chen等[22]發(fā)現(xiàn)五指山小型豬和巴馬小型豬在高糖高脂飼喂6個月后，開始出現(xiàn)肥胖、血清胰島素升高和胰島素敏感性下降等糖代謝異常現(xiàn)象，開始實驗8個月后，五指山小型豬和巴馬小型豬發(fā)展為糖尿病或出現(xiàn)2型糖尿病前期表現(xiàn)，中國農(nóng)大小型豬出現(xiàn)胰島素敏感性減低，而空腹血糖水平、血清胰島素含量、胰島素敏感指數(shù)和IVGTT在實驗過程中一直無顯著變化，表現(xiàn)出對高糖高脂飼料致糖尿病反應(yīng)不敏感。

單純高糖高脂飲食誘導(dǎo)小型豬2型糖尿病不但成模時間長，飼養(yǎng)成本高，而且體質(zhì)量增長快不利于后續(xù)實驗操作。 模型組給予不同配比的高脂飼料所得血液生化指標結(jié)果略有不同，給予更高比例的油脂和蔗糖使得小型豬的血糖和三酰甘油值更高，且外源性添加膽固醇會使得小型豬血液中膽固醇含量顯著升高，從而增加患動脈粥樣硬化和冠心病等心腦血管疾病的風險(見表2)。單純高糖高脂飲食誘導(dǎo)容易獲得肥胖或者代謝綜合征模型，但要想獲得典型的“三多一少”2型糖尿病模型需要半年以上到1年的造模時間[23]。

2.2 藥物結(jié)合高糖高脂飲食誘導(dǎo)

常用于豬、嚙齒動物、兔子和非人靈長類動物制備2型糖尿病的藥物有鏈脲佐菌素和四氧嘧啶，兩者均為具有毒性的葡萄糖類似物，能通過位于細胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(glucose transporter 2，GLUT2)轉(zhuǎn)運到細胞中。ALX產(chǎn)生有毒自由基通過壞死導(dǎo)致胰島β細胞死亡；STZ一進入細胞就被分解產(chǎn)生游離的甲基亞硝基脲，誘導(dǎo)DNA片段化和加速細胞壞死[26]。二者選擇性的破壞胰島β細胞，使胰島素分泌量下降和血糖水平升高，這兩種藥物既可以單獨使用亦可聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)合高糖高脂飲食可更快速的制備2型糖尿病模型。

STZ的半衰期較ALX的半衰期長，注射時的溶液較為穩(wěn)定，STZ對胰島β細胞外的細胞毒性較小，動物死亡率較低，因此STZ誘導(dǎo)造模的重復(fù)性比ALX的更好[27]。在制作小型豬2型糖尿病模型時，使用ALX可對肝、腎組織造成毒性損害，動物的死亡率較高，而且所制備的動物模型長期穩(wěn)定性較差，1～2周后可由殘存胰島細胞代償作用而使其恢復(fù)為正常狀態(tài)；使用STZ要優(yōu)于ALX，STZ造模快速穩(wěn)定而且種屬選擇性不強，造模前不需要嚴格禁食等[28]。

田忠等[29]對小型豬靜脈注射高劑量150 mg/kg STZ，觀察肝腎功能指標發(fā)現(xiàn)肝功能基本維持正常，而腎小管的重吸收功能部分受損，證實STZ制備小型豬糖尿病模型的安全性和可靠性。

Ludvigsen等[30]對高脂肪高膽固醇飲食的哥廷根小型豬單次靜脈給予高劑量125 mg/kg STZ，然后靜脈注射67 mg/kg煙酰胺來保護部分胰島β細胞，誘導(dǎo)后小型豬出現(xiàn)明顯胰島素抵抗，中度三酰甘油血癥和重度高膽固醇血癥。

肖國華等[31]每天給予版納微型豬高糖高脂飼料，在1個月后腹腔一次性注射50 mg/kg STZ，7個月后耳緣靜脈注射50mg/(kg·d) STZ，連續(xù)3 d，小型豬血糖、三酰甘油和總膽固醇水平升高，產(chǎn)生胰島素抵抗，初步建立了較為理想的2型糖尿病動物模型。

Wu等[32]將廣西巴馬小型豬分成4組，其中10頭為高糖高脂飼料喂養(yǎng)10個月(DM1-HH組)，4頭為6個月高糖高脂飼料喂養(yǎng)，接著注射60 mg/kg STZ后繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料4個月(DM2-HS組)，4頭為注射60 mg/kg STZ后標準飲食喂養(yǎng)6個月，高糖高脂飼料喂養(yǎng)4個月(DM3-SH組)，10個月后，DM1-HH組10頭豬中只有4頭符合糖尿病模型標準，注射STZ的組別均符合糖尿病標準，且DM2-HS組胰島素抵抗更為嚴重，認為先高糖高脂飼養(yǎng)一段時間再注射STZ可獲得更嚴重2型糖尿病模型。

于健等[34]使用高糖高脂飼料喂養(yǎng)模型組小型豬11個月后給予腹腔注射STZ 100 mg/kg，并在1周后重復(fù)注射上述劑量1次，模型組FPG穩(wěn)定維持在9.8～15.6 mmol/L水平，成功構(gòu)建具有典型“三多一少”糖尿病癥狀的2型糖尿病小型豬模型。

吳延軍等[35]在實驗組巴馬小型豬高糖高脂飲食6個月后按60 mg/kg 一次性靜脈注射STZ，再連續(xù)觀察3個月發(fā)現(xiàn)，制備出穩(wěn)定性好、2型糖尿病特征明顯的小型豬模型。

通過使用STZ或ALX等化學藥物結(jié)合高糖高脂飲食能快速損傷胰島β細胞、降低胰島素水平導(dǎo)致高血糖，能建立典型2型糖尿病模型，但不具備肥胖特征，而且在選擇藥物誘導(dǎo)劑量時需考慮到不同品系對藥物敏感性的不同，以便建立理想模型。見表3。

當使用較低劑量60 mg/kg STZ時，小型豬胰島素長期代償性升高；當使用中低劑量80～100mg/kg時，小型豬血糖較高且胰島素分泌相對不足；當使用STZ造模的劑量過大時可能會出現(xiàn)酮癥酸中毒致使小型豬死亡的現(xiàn)象[36]。見表3。

Vériter[37]等對豬靜脈注射不同劑量的STZ，30～50 mg/kg劑量的STZ可重構(gòu)胰島內(nèi)胰島β細胞和α細胞的比例使之更接近于人的比例(人的比例為60%和25%，豬的比例為90%和8%)，胰島α細胞的比例隨著STZ劑量的增加而增加，使胰高血糖素的分泌增加，β細胞內(nèi)cAMP濃度增加， 從而響應(yīng)葡萄糖刺激誘導(dǎo)胰島素分泌。注射30和50 mg/kg STZ后β細胞比例降低30%并不影響葡萄糖攝取，破壞30%的β細胞后沒有明顯的糖尿病跡象，而葡萄糖耐受不良和糖尿病發(fā)生時β細胞分別減少了50%和90%，這就解釋了為什么低劑量的STZ對豬的葡萄糖代謝沒有影響。

3 生物學指標的變化

2型糖尿病成模小型豬毛發(fā)粗糙無光澤，活動量減少，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，飲水量增多，排尿量增多。與正常對照組小型豬比較，藥物STZ或ALX破壞胰島細胞造模的小型豬體質(zhì)量顯著下降而后才緩慢上升。

2013版中國糖尿病防治指南診斷標準[38]為：⑴典型的“三多一少”糖尿病癥狀和隨機血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dL)或加上⑵空腹血糖≥7.0 mmol/L(126 mg/dL)或加上⑶葡萄糖負荷后2h血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dL)。2018年美國糖尿病學會發(fā)布的2018年糖尿病醫(yī)學診療標準[39]認為空腹血糖、餐后2h血糖和糖化血紅蛋白仍是診斷糖尿病和糖尿病前期的標準，但如果測得的血糖水平和糖化血紅蛋白之間明顯不一致則需考慮是否血紅蛋白變異干擾血紅蛋白檢測的可能。

表3 STZ靜脈注射用量對血糖(FPG)、胰島素(FINS)和胰島素抵抗指數(shù)(HOME-IR)的影響Table 3 Effect of STZ intravenous injection on blood glucose,insulin and insulin resistance index

研究表明，小型豬的胰腺發(fā)育、結(jié)構(gòu)及葡萄糖代謝機制與人類的相似，空腹血糖值也與人類的相近，故可用人類糖尿病診斷標準作為參考。成功構(gòu)建2型糖尿病模型的小型豬會導(dǎo)致胰島素抵抗水平升高，胰島素敏感性下降，糖耐量實驗葡萄糖利用率下降，血清三酰甘油和膽固醇水平升高，C肽水平下降，餐后GLP-1的分泌減少，血清肌酐水平下降，尿酸增加，尿素減少。衡量胰島β細胞功能的經(jīng)典指標是胰島素，C肽與胰島素有一個共同的前體是胰島素原，一個胰島素原分子經(jīng)酶切后，裂解成一個分子的胰島素和一個分子的C肽，二者從分泌顆粒同時釋放到毛細血管參與血液循環(huán)中，并且C肽不會被肝臟破壞，半衰期明顯較胰島素長，故測定血中C肽水平更能準確反映胰島β細胞的分泌功能。

2型糖尿病小型豬的病理結(jié)果顯示：胰島明顯萎縮，胰島β細胞數(shù)目明顯減少；腎臟脂肪沉積，腎小球出現(xiàn)肥大、系膜擴張、炎性細胞浸潤、透明小管擴張；肌纖維普遍出現(xiàn)萎縮，部分肌纖維排列紊亂而且明暗帶不規(guī)則，部分肌纖維的細胞核增多、形態(tài)及位置異常；牙周結(jié)締組織明顯疏松排列混亂，且網(wǎng)狀纖維破壞，血管化明顯，局部出現(xiàn)富含血管的肉芽組織和大量的炎性細胞浸潤[11,23]。2型糖尿病小型豬各組織的糖脂代謝、炎性反應(yīng)和細胞凋亡等病理特征與人類2型糖尿病特征相似。

4 轉(zhuǎn)基因動物模型

利用轉(zhuǎn)基因和基因打靶技術(shù)來建立動物疾病模型是目前動物模型的研究熱點之一。自從2001年第一頭體細胞核移植轉(zhuǎn)基因克隆豬誕生后，轉(zhuǎn)基因小型豬糖尿病模型在技術(shù)上才獲得突破[40]。

Renner等[41]培育INSC94Y轉(zhuǎn)基因豬建立了永久性新生兒糖尿病豬模型，INSC94Y轉(zhuǎn)基因豬β細胞胰島素分泌較對照組明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴重擴張，且伴發(fā)的白內(nèi)障隨著年齡的增加病情越來越嚴重。Streckel等[42]的GIPRdn轉(zhuǎn)基因出現(xiàn)豬胰島β細胞數(shù)量減少，胰島素分泌減少，體質(zhì)量的增加也減少，葡萄糖耐量受損等的糖尿病癥狀。Kong[43]等使用取自五指山小型豬豬胚胎成纖維細胞作為體外體細胞核移植的供體細胞，以特定的多順反子系統(tǒng)構(gòu)建分別在豬肝臟組織特異性表達11β-HSD1基因，在胰島β細胞特異性表達hIAPP基因和CHOP基因的三基因過表達載體，制備了3頭轉(zhuǎn)基因五指山仔豬，結(jié)果顯示肝臟中11β-HSD1的過表達使肝脂參數(shù)升高，胰島細胞hIAPP和CHOP的過表達導(dǎo)致β細胞發(fā)育遲緩和凋亡。

國內(nèi)實驗小型豬用于制作轉(zhuǎn)基因小型豬糖尿病及相關(guān)模型還較為欠缺，雖然高糖高脂飲食誘導(dǎo)或結(jié)合藥物誘導(dǎo)可以建立2型糖尿病模型，但由于糖尿病是涉及許多機制參與的多基因遺傳的復(fù)雜疾病，通過轉(zhuǎn)基因和基因打靶技術(shù)制作的模型可用于糖尿病相關(guān)基因的功能及致病機制的研究。

5 展望

不同的方法構(gòu)建的2型糖尿病模型具有一定獨特的生物學特征，可適合不同的研究需求。應(yīng)根據(jù)研究的需求，采用不同的方法復(fù)制相應(yīng)的2型糖尿病模型。見表4。

表4構(gòu)建小型豬2型糖尿病模型的不同方法及其特點和應(yīng)用范圍

Table4EDifferent methods of constructing miniature pig type 2 diabetes mellitus and their characteristics and application scope

造模方法特點應(yīng)用范圍HSHFD肥胖引起的2型糖尿病模型2型糖尿病前期和糖尿病期及其并發(fā)癥的藥效評價及發(fā)病病理機制研究STZ/ALX+HSHFD快速形成“三多一少”2型糖尿病模型2型糖尿病晚期和糖尿病期及其并發(fā)癥的藥效評價及發(fā)病病理機制研究轉(zhuǎn)基因技術(shù)糖尿病相關(guān)基因缺失或過表達遺傳性糖尿病的病理機制研究

致謝：

本文撰寫過程中得到貝偉劍研究員提供的寶貴建議。