王曉翔，岑梓文，馮冰虹

(廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006)

肝病為危害人類健康的危險因素之一，全球每年有超過100萬人死于病毒性肝炎[1]，許多急性肝炎患者和肝炎病毒攜帶者可轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝谆颊?，慢性肝炎部分可發(fā)展為肝硬化，最終導致肝癌，我國肝癌的發(fā)病率約占全球肝癌死亡人數(shù)的40%，已經(jīng)成為我國面臨的嚴重公共衛(wèi)生問題之一[2-3]。肝纖維化(hepatic fibrosis)是由多種原因引起的慢性肝損傷的常見結(jié)果，是肝臟對一系列慢性刺激損傷修復(fù)的病理反應(yīng)，以細胞外基質(zhì)過度沉積為主要特征[4]。目前為止，仍然未出現(xiàn)獲得臨床批準使用的抗纖維化的藥物，因此研制有效的抗纖維化藥物是現(xiàn)今研究的熱點[5]。人肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活與增殖是肝纖維化形成的核心環(huán)節(jié)，HSCs的激活機制及抑制活化途徑的研究已成為防治肝纖維化的關(guān)鍵。目前國際上抗肝纖維化藥物研發(fā)的思路是從肝纖維化發(fā)生機制中尋找靶點，由于HSC激活是多個信號傳導途徑協(xié)調(diào)的結(jié)果，其復(fù)雜性和未知因素導致阻斷模式的特異性和多樣性。新近研究進展表明，表觀遺傳學的異常調(diào)控可能是肝纖維化發(fā)病機制和發(fā)展的主要驅(qū)動力[6]，主要表現(xiàn)為由組蛋白乙酰化(histone acetylation)所參與的調(diào)節(jié)HSCs的活化增殖環(huán)節(jié)，并提出組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)可能是具有較高潛在應(yīng)用價值的特異性靶標[7-8]。

伏立諾他(vorinostat，SAHA)為首個被美國FDA 批準上市的 HDAC抑制劑，屬于異羥肟酸類藥物，對博來霉素所誘導的特發(fā)性肺纖維化有顯著的修復(fù)作用[9]。

小分子化合物 N2E與SAHA 同屬異羥肟酸類，其化學名稱為N-(2-乙氧基苯基)-N′-羥基辛二酰胺，對HDAC的抑制效果比SAHA強2倍以上[10]。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，小分子化合物 N2E有良好的抗肝纖維化作用，可逆轉(zhuǎn)纖維化，減少肝臟損害。本研究旨在進一步探討N2E誘導人肝星狀細胞LX-2細胞凋亡作用，初步明確其抗肝纖維化的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人肝星狀細胞LX-2由廣東藥科大學蘭天博士肝纖維化研究小組提供。N2E通過特殊方法合成[10]。SAHA(大連美倫生物科技公司)；細胞周期試劑盒、AnnexinV-APC/PI 試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒、Caspase-3分光光度計法檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；HDAC3一抗(1∶4 000，Abcam)、Caspase-3一抗(1∶500)、α-SMA一抗(1∶500)、TGF-β1一抗(1 500)均購自萬類生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(Thermo公司)；胎牛血清(FBS，Gibico公司)；ECL化學發(fā)光液(Bio-Rad公司)。

1.2 主要儀器

SW-CJ-2F型凈化工作臺(蘇州凈化有限公司)；水套式CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；光學顯微鏡(Nikon公司)；流式細胞儀(BD FACSCalibur公司)；SPD-M20A 分光光度計(日本島津公司)。

1.3 細胞流式檢測N2E作用LX2細胞的細胞周期

分別設(shè)置空白對照組，N2E(2.5、5、10 μmol/L)組，SAHA(10 μmol/L)組，給藥24 h后，離心采集細胞，棄上清，用預(yù)先冷卻的PBS洗滌細胞2次，加入預(yù)先冷卻的70%(體積分數(shù),下同)乙醇重懸液，于4 ℃固定過夜，或-20 ℃長期固定。細胞染色，離心收集細胞，每次1 mL PBS洗滌細胞，加入 PBS[包括試劑盒中提供的5 μg/ mL碘化物C錠(PI)]500 μL，100 μg/mL RNaseA、0.2%Triton X-100)4 ℃避光孵育30 min。流式細胞儀分析：以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數(shù)1×105個細胞以上，結(jié)果用細胞周期擬合軟件Flowjo分析。

1.4 AnnexinV-APC/PI雙染法檢測N2E對LX-2細胞的凋亡作用

分別設(shè)置空白對照組、N2E(2.5、5、10 μmol/L)組，SAHA(10 μmol/L)組，給藥24 h后收集細胞，PBS洗滌1次，然后用1×結(jié)合緩沖液洗滌; 使用1×Binding緩沖細胞和計數(shù)，細胞數(shù)為5×106/mL; 收集細胞，分別加入膜聯(lián)蛋白V-APC、PI 各5 μL，室溫孵育15 min，加入1×Binding緩沖液重懸液400 μL 混勻，流式細胞儀檢測并分析數(shù)據(jù)。

1.5 MMP法檢測N2E對LX-2細胞凋亡作用

分別設(shè)置空白對照組、N2E(2.5、10 μmol/L)組、SAHA(10 μmol/L)組以及線粒體膜電位檢測試劑盒提供的陽性對照CCCP組。N2E、SAHA組處理24 h后，收集細胞上清以及細胞后離心，去上清，根據(jù)試劑盒說明書進行操作染色，通過流式細胞儀進行正常線粒體膜電位(MMP)的檢測。采用Flowjo軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，得到各組的細胞MMP變化特點。

1.6 分光光度計法檢測N2E作用LX-2后Caspase-3的活性

取試劑盒提供的標準品，根據(jù)說明繪制標準曲線(y=331.320 3x+0.242 3，R2=0.997 1)，分別設(shè)置空白對照組、N2E(2.5、10 μmol/L)組、SAHA(10 μmol/L)組，種皿給藥后，收集細胞并裂解。根據(jù)試劑盒說明書對樣品進行處理。最后將處理好的樣品放于波長450 nm處測定吸光度(A值)，根據(jù)標準曲線計算出N2E作用LX-2后Caspase-3的活性。

1.7 免疫蛋白印跡

將生長良好、密度合適的肝星狀細胞系LX-2細胞，培養(yǎng)24 h后，分別加入含2.5、5、10 μmol/L的N2E和10 μmol/L的SAHA，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。N2E由無菌DMSO溶解后，配置成5 mmol/L濃度的母液。裂解液裂解后收集細胞至EP管中，4 ℃離心35 min(12 000 r/min)，取上清液進行細胞定量，將蛋白進行電泳以及轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h后，一抗和內(nèi)參β-actin在4 ℃孵育過夜，次日二抗孵育45 min，采用增強化學發(fā)光液(ECL)發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 細胞周期法檢測N2E對LX-2的凋亡誘導作用

利用 FlowJo V7.6.2軟件對N2E處理過的LX-2細胞進行不同時期的模擬分析 (圖1 A)。并根據(jù)G1、S、G2期細胞數(shù)占總數(shù)的百分比進行統(tǒng)計(圖1 C)。對比空白對照組，可以觀察到N2E組在G1期細胞占總數(shù)的百分比減少，且在高濃度較為明顯(對比低、中濃度，高濃度下降了17.08%)。而在S期，細胞占總數(shù)的百分比隨著藥物濃度的增加而逐漸增加(從低濃度的8.53%逐漸上升至高濃度的14.46%)，且呈現(xiàn)濃度依賴性。N2E組在細胞的G2/M期細胞占總數(shù)的百分比有一定提升，但變化不明顯，且沒有濃度依賴性。說明N2E可能是通過阻滯細胞于S期，使其DNA損傷，影響DNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制，來達到抑制LX-2細胞增殖的作用。這與陽性藥物SAHA組結(jié)果一致。

2.2 AnnexinV-APC/PI雙染法檢測N2E對LX-2的凋亡誘導作用

如圖1 B所示，空白對照組的成活率和細胞凋亡率分別在80%以上和20%以下。N2E或SAHA治療24 h后,觀察到明顯的細胞凋亡 (圖1 D)。在 2.5 μmol/L N2E的作用下,LX-2細胞的總凋亡率為23.32%；隨著濃度的增加，LX-2細胞的凋亡率增加；在10 μmol/L N2E作用下，LX-2細胞總凋亡率為63.22% (P<0.01)。結(jié)果表明N2E可顯著誘導人肝星狀細胞凋亡。

A. N2E對人肝星狀細胞LX-2細胞周期的影響； B. N2E對人肝星狀細胞LX-2凋亡率的影響； C. N2E對LX-2細胞周期的影響； D. N2E對人肝星狀細胞LX-2凋亡率的影響； E. N2E對人肝星狀細胞LX-2 MMP的影響； F.N2E對人肝星狀細胞LX-2 Caspase-3活性的影響；與空白對照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

2.3 MMP法檢測N2E對LX-2的凋亡誘導作用

如圖1 E所示，N2E對人肝星狀細胞作用24 h，當濃度為2.5 μmol/L N2E時，MMP變化并不明顯，當濃度遞增至10 μmol/L時，可觀察到MMP較空白對照組以及低濃度組明顯下降(P<0.05)，此外SAHA的MMP變化與空白對照組對比沒有明顯變化，而CCCP陽性對照組則同高濃度N2E組一樣，表現(xiàn)出明顯的下降變化，保證了實驗的準確性。

2.4 Caspase-3分光光度計法檢測N2E對LX-2的凋亡誘導作用

如圖1 F所示，N2E作用LX-2細胞24 h后，其細胞的Caspase-3活性與對照組相比明顯增強；SAHA作用LX-2后，Caspase-3活性并無明顯的變化。而2個濃度的N2E均能顯著增加Caspase-3的活性(P<0.01)，提示N2E可能通過調(diào)控Caspase-3來誘導人肝星狀細胞LX-2凋亡。

2.5 N2E作用LX-2后對HDAC3、α-SMA、Caspase-3以及TGF-β1蛋白表達的影響

與對照組相比，3個濃度的N2E(2.5、5.0、10.0 μmol/L)均能顯著下調(diào)HDAC3、α-SMA、TGF-β1以及Caspase-3的表達水平，并促進Cleaved-Caspase-3蛋白的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。同時，N2E對LX-2細胞中的TGF-β1表達也均有下調(diào)作用，與陽性藥SAHA實驗結(jié)果一致。見圖2。

3 討論

細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂開始到下一次分裂結(jié)束的整個過程，包括DNA合成相關(guān)的細胞間期(G1期、S期、G2期)以及細胞分裂期(M期)2個階段。細胞周期的檢測結(jié)果顯示N2E能阻滯LX-2細胞于S期，且呈現(xiàn)濃度依賴性，與陽性藥物SAHA組的結(jié)果一致。S期為細胞復(fù)制過程中1倍DNA到2倍DNA的階段，N2E阻滯LX-2細胞停滯在S期，可能是通過使其DNA損傷，影響DNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制，從而達到抑制LX-2細胞增殖的作用。結(jié)果提示N2E不但可以抑制細胞增殖，還能誘導細胞發(fā)生凋亡。肝星狀細胞在肝纖維化的發(fā)生以及發(fā)展過程中都起到了重要的作用，誘導肝星狀細胞凋亡也是抗肝纖維化的一種治療方式[11]。隨后通過流式細胞術(shù)定量檢測LX-2的細胞凋亡率，使用帶有熒光的APC標記的Annexin V-APC，選擇性地與細胞早期凋亡時出現(xiàn)細胞外翻至細胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸相結(jié)合，然后通過流式細胞儀檢測是否存在凋亡現(xiàn)象。結(jié)果顯示，隨著N2E的濃度遞增，細胞發(fā)生凋亡的比率顯著增加，表明N2E能誘導肝星狀細胞LX-2發(fā)生凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴性。

A. Western blot檢測N2E對LX-2中HDAC3、α-SMA、TGF-β1以及Caspase-3、Cleaved-Caspase3的蛋白表達影響； B.蛋白表達統(tǒng)計分析；與空白對照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖2N2E對LX-2細胞中HDAC3以及相關(guān)蛋白的影響

MMP是維持細胞線粒體氧化磷酸化并產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件，而MMP的穩(wěn)定性是維持細胞正常生理功能的前提。 MMP下降是細胞早期凋亡的重要標志。通過檢測LX-2在N2E作用下MMP的變化，發(fā)現(xiàn)10 μmol/L N2E作用LX-2后，細胞線粒體膜電位明顯降低，提示LX-2在N2E作用下可能發(fā)生早期凋亡。在細胞凋亡過程中，Caspase家族起到十分重要的作用，其中Caspase-3與染色體凝聚、DNA斷裂、凋亡小體形成等密切相關(guān)[12]。細胞發(fā)生凋亡時，活化后的Caspase-3能通過影響細胞胞漿或者胞核底物來誘導細胞進一步凋亡。通過分光光度計法檢測了N2E作用LX-2后Caspase-3的活性，檢測結(jié)果進一步說明了N2E誘導LX-2凋亡與活化Caspase-3有關(guān)。

有研究提示，HDAC3調(diào)節(jié)了TGF-β1的穩(wěn)定性[13]，研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化形成和逆轉(zhuǎn)過程中Ⅰ型膠原和α-SMA的表達變化伴隨著HDACs的表達變化。轉(zhuǎn)染實驗分析也證明HDAC3的沉默可以恢復(fù)因TGF-β1所誘導的Ⅰ型膠原和α-SMA的高表達，可見抑制HDAC3可以起到逆轉(zhuǎn)纖維化的作用。

本實驗證明了N2E可明顯下調(diào)肝星狀細胞LX-2中HDAC3、α-SMA、TGF-β1和Caspase-3的蛋白表達，以及促進活化后的Cleaved-Caspase-3的表達，說明N2E可能通過作用靶蛋白HDAC3來促進與凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3，同時抑制α-SMA以及TGF-β1的表達，提示N2E通過抑制HDAC3來誘導肝星狀細胞LX-2的凋亡，同時也抑制TGF-β1以及α-SMA的表達。本研究結(jié)果為組蛋白去乙?；敢种苿㎞2E在抗肝纖維化治療中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。