張亞倩,徐鵬程,張琴,徐榕,張文峰,沈晗,陶嫦立,邵紅偉

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與物物制藥學(xué)院,廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510006)

甘草是豆科甘草屬中一類多年生的草本植物，是一味大宗藥材,具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳、調(diào)和諸藥之功效,素有 “十藥九草”、“無草不藥”之稱[1]。甘草化學(xué)組成極為復(fù)雜，含有多種化學(xué)成分，主要成分有甘草酸、甘草甙等。大量的研究表明，甘草酸和黃酮類物質(zhì)是甘草中最重要的生理活性物質(zhì)，甘草雖然具有良好的藥用價(jià)值，但是過量服食甘草卻會(huì)有一些不良反應(yīng)。從1994年開始，已有很多研究表明[2-8]，長期服用甘草片或者含有甘草類藥物，會(huì)導(dǎo)致低鉀血癥。K+的主要生理作用是維持細(xì)胞的正常代謝與酸堿平衡、細(xì)胞膜的應(yīng)激性和心肌的正常功能。血清K+濃度<3.5 mmol/L稱為低鉀血癥,可出現(xiàn)一系列的癥狀和體征[9]。已有報(bào)道顯示[10]，甘草導(dǎo)致低鉀血癥的主要機(jī)制是甘草酸經(jīng)腸道菌降解后生成甘草次酸，甘草次酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與皮質(zhì)酮相似，可模擬醛甾酮發(fā)揮腎上腺鹽皮質(zhì)激素樣作用。且已有研究發(fā)現(xiàn)低鉀血癥甚至?xí)饳M紋肌溶解[11-14]。本研究進(jìn)一步探索Na+/K+ATPase在甘草性低鉀血癥中的作用，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甘草產(chǎn)地甘肅，產(chǎn)品批號(hào)YPA6A0002,經(jīng)廣東藥科大學(xué)楊全教授鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch；甘草酸購于廣州華奇盛生物科技有限公司；烏苯苷購于廣州威佳科技有限公司；SBRY GREEN購于上海翊圣生物科技有限公司，GoScriptTMReverse Transcription System購于北京promega公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE311(上海Yamato科技)；BSA124S-CW分析天平TLE204(德國Sartorius公司)；VORTEX-6渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；LightCycler480Ⅱ(瑞士Roche公司)；Olympus AU5431全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司);貝克曼庫爾特iRICELL 3000全自動(dòng)生化儀(美國BeckmanCoulter公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡BALB/C小鼠15只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0034。

1.3 甘草水提物的制備

精確稱取甘草25 g，加入屈臣氏蒸餾水100 mL浸泡20 min,60 ℃煎煮2 h，使用8層紗布過濾于燒杯中；將藥渣再加入100 mL屈臣氏蒸餾水中，相同方法煎煮2 h，2次濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至25 mL(80 ℃，0.08 MPa,14 r/min)制成質(zhì)量濃度為1 g/mL的甘草水提物[15]。

1.4 動(dòng)物分組處理

根據(jù)中國藥典中甘草用量為2～10 g,以人與動(dòng)物表面積換算折算法為依據(jù)[16]，設(shè)置小鼠灌胃甘草水提物高劑量為7.5 g/kg。以甘草酸為對(duì)照，按文獻(xiàn)[17]所述甘草水提物中含有5%的甘草酸計(jì)算對(duì)照組甘草酸的用量。將15只8周齡SPF級(jí)BALB/C小鼠隨機(jī)分為3組，分別為甘草水提物高劑量組(GE，7.5 g/kg)、甘草酸組(GA，0.375 g/kg)、空白對(duì)照組(Control)。灌胃7 d造模，造模成功后第8天利用全自動(dòng)生化儀檢測尿液和糞便中K+的含量。第9天下午腹腔給藥烏苯苷0.2 mL/只(劑量為300 μg/kg)[18]，第10天檢測小鼠尿液和糞便中K+的含量。第13天藥效消除后檢測小鼠尿液和糞便中K+的含量。喂養(yǎng)期間，小鼠自由飲食。

1.5 小鼠腸道的收集

最后1次灌胃24 h后，解剖小鼠后取小鼠回腸，分為2份，收集近端回腸，每組100 mg，置于1.5 mL干燥的滅菌EP管中，液氮保存；收集遠(yuǎn)端回腸和結(jié)腸，PBS沖洗干凈后，分別置于4%(φ)多聚甲醛中，送至武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行HE染色后電鏡下觀察腸道病理狀態(tài)并拍照。

1.6 RNA提取與基因表達(dá)檢測

使用液氮速凍及Trizol法提取回腸組織總RNA，取部分腸道組織RNA送至諾唯贊生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，其余樣品-80 ℃條件下保存。

1.7 RT-PCR驗(yàn)證

利用GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒將所提取的總RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。利用熒光定量PCR驗(yàn)證小鼠相關(guān)基因的表達(dá)情況，通過RT-QPCR驗(yàn)證醛固酮通路相關(guān)基因的改變，確定這些基因的表達(dá)改變和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，所用PCR引物見表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primers for real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 高劑量甘草對(duì)小鼠體質(zhì)量和行為學(xué)的影響

高劑量甘草對(duì)小鼠體質(zhì)量影響見圖1。各組小鼠體質(zhì)量沒有大幅度變化，所有小鼠無死亡；甘草高劑量水提物小鼠灌胃后出現(xiàn)低鉀性周癱性癥狀，四肢無力，不走動(dòng)，短時(shí)間內(nèi)不進(jìn)食、不飲水，5 h后，小鼠癥狀略有緩解，開始緩慢進(jìn)食，走動(dòng)依舊遲緩；與空白對(duì)照組比較，小鼠活躍程度顯著降低。甘草酸的小鼠行為學(xué)上與空白對(duì)照組比較無顯著變化。

圖1甘草誘導(dǎo)的各組小鼠體質(zhì)量變化

Figure1Change of weight in mice induced by Glycyrrhiza uralensis decoction

2.2 小鼠腸道組織醛固酮通路基因的表達(dá)

見圖2A，甘草水提物灌胃組與甘草酸灌胃組均對(duì)小鼠腸道基因產(chǎn)生了影響，但甘草水提物灌胃組的上下調(diào)基因多于甘草酸組，說明灌胃甘草水提物對(duì)腸道產(chǎn)生的影響大于甘草酸。

見圖2B。甘草高劑量組和空白對(duì)照組比較，在醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收通路中，發(fā)現(xiàn)ATPase、MR、SGK1、NHERF2出現(xiàn)了明顯變化,ATPase、NHERF2上調(diào)，而SGK1下調(diào)。結(jié)合前期研究結(jié)果和文獻(xiàn)總結(jié)，把ATPase作為醛固酮通路的檢測目標(biāo)，通過對(duì)這個(gè)基因的研究來挖掘小鼠低鉀血癥的相關(guān)機(jī)制。

本研究中設(shè)計(jì)了醛固酮通路相關(guān)基因的引物(見表1)，通過RT-QPCR驗(yàn)證確定這些基因的表達(dá)改變和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

2.3 小鼠HE染色結(jié)果顯示腸道通透性改變

見圖3。小鼠回腸病理結(jié)果顯示，甘草水提物灌胃組的黏膜層可見較多炎性細(xì)胞浸潤(黃色箭頭)；甘草酸灌胃組可見腸黏膜層上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，腸腺豐富、排列緊密，未見明顯炎癥；空白對(duì)照組的黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整，腸腺豐富、排列緊密。甘草酸灌胃引起小鼠腸道狀態(tài)的改變幾乎與對(duì)照組無差異，而灌胃甘草水提物對(duì)腸道生理狀態(tài)產(chǎn)生的顯著性影響，腸道通透性受損，腸道免疫屏障被破壞導(dǎo)致腸道出現(xiàn)炎癥。

小鼠結(jié)腸病理結(jié)果顯示，甘草水提物灌胃組的局部黏膜層可見少量腸腺壞死，杯狀細(xì)胞核固縮深染(黑色箭頭)，并伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(黃色箭頭)；甘草酸灌胃組可見局部黏膜層壞死，腸腺結(jié)構(gòu)消失(黑色箭頭)，并伴有較多炎性細(xì)胞浸潤(黃色箭頭)；空白對(duì)照組的黏膜層多見少量炎性細(xì)胞浸潤(黑色箭頭)；肌層局部可見水腫，肌纖維排列疏松(黃色箭頭)。和對(duì)照組相比，甘草水提物灌胃組和甘草酸灌胃組都出現(xiàn)腸腺結(jié)構(gòu)被破化。

2.4 Na+/K+ATPase抑制劑逆轉(zhuǎn)小鼠尿及糞便K+的影響

見圖4A。給藥高劑量甘草水提物可以導(dǎo)致小鼠的尿鉀降低，當(dāng)給藥Na+/K+ATPase抑制劑烏苯苷后，小鼠尿液中的K+濃度隨著烏苯苷的藥效發(fā)揮而上升，隨著烏苯苷藥效的消除，小鼠K+濃度又逐漸下降，說明高劑量甘草水提物造成的低鉀血癥的尿鉀降低可以通過烏苯苷有效逆轉(zhuǎn)。從圖4B可以發(fā)現(xiàn)，高劑量甘草水提物組小鼠糞便中的K+濃度遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組，而甘草酸組與空白對(duì)照組無顯著性差異，給藥Na+/K+ATPase抑制劑后，各組糞便中的K+濃度沒有顯著性差異。

A.轉(zhuǎn)錄組火山圖顯示差異基因分布情況(甘草水提物灌胃組、甘草酸灌胃組與空白對(duì)照組比較)； B.轉(zhuǎn)錄組測序顯示醛固酮通路相關(guān)基因的表達(dá)變化(甘草水提物灌胃組、甘草酸灌胃組與空白對(duì)照組比較)； C. real-timePCR確認(rèn)ATPase、NHERF2、MR、SGK1的表達(dá)變化(與空白對(duì)照組比較，**P<0.01)。

圖2小鼠腸道組織醛固酮通路基因的表達(dá)情況
Figure2Expression of genes in abdosterone pathay intestinal tissue of mice

甘草高劑量水提物造模組小鼠糞便中的K+濃度遠(yuǎn)高于空白對(duì)照，而給藥Na+/K+ATPase抑制劑后，糞便中的K+濃度無明顯變化。造成K+在血液中含量少的原因一是吸收減少，另一是排泄增多，導(dǎo)致體內(nèi)總量減少，由本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尿液中的K+濃度相應(yīng)減少，而糞便中的濃度反而增多,說明K+在血液中含量低的原因是吸收減少，多余的K+隨著胃腸道排出體外。

3 討論

高劑量甘草水提物會(huì)導(dǎo)致小鼠低鉀血癥，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致肌肉乏力，橫紋肌溶解[19]，如若不能及時(shí)補(bǔ)鉀，情況會(huì)加劇，甚至出現(xiàn)生命危險(xiǎn)。所以本研究探索了高劑量甘草水提物造成小鼠低鉀血癥的分子機(jī)制，為低鉀血癥的臨床治療提供一定基礎(chǔ)研究。

有研究表明,過量的甘草及其衍生物能夠影響水鹽平衡[20]，造成不良后果。在本研究中，造模低鉀血癥后檢測小鼠尿液中K+濃度，發(fā)現(xiàn)造模組小鼠尿液中的K+明顯低于空白組，而甘草酸灌胃組與空白組K+濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明小鼠出現(xiàn)低鉀血癥后，血液中的K+濃度降低的同時(shí)尿液中的K+濃度也降低了，表明低鉀血癥小鼠K+的減少不是從泌尿系統(tǒng)排出體外的。為了弄清楚小鼠體內(nèi)K+降低的機(jī)制，收集了小鼠的糞便并檢測其中的K+濃度，發(fā)現(xiàn)造模組小鼠糞便中的K+濃度顯著高于對(duì)照組，表明低鉀血癥小鼠的K+減少是由胃腸道失鉀引起的。本研究發(fā)現(xiàn)單純使用甘草酸對(duì)小鼠進(jìn)行處理，并不會(huì)引起低鉀血癥，其原因可能是甘草酸的劑量不夠，本研究所用的甘草酸劑量是參考其在甘草水提物中的含量設(shè)定的[17]，考慮到甘草水提物中還含有其他的鹽皮質(zhì)激素類似物，因此只用其中所含的甘草酸的劑量可能短時(shí)間內(nèi)不會(huì)引起低鉀血癥。

A.回腸； B.結(jié)腸。

圖3小鼠腸道病理結(jié)果
Figure3Pathological results of intestinal in mice(HE，200×)

A.各組小鼠尿液中K+的變化(箭頭表示給藥烏苯苷)； B.各組造模時(shí)糞便K+濃度值; C.各組給藥烏苯苷后糞便K+濃度值。 與空白對(duì)照組比較:**P<0.01。

圖4Na+/K+ATPase抑制劑對(duì)小鼠尿及糞便K+的影響

Figure4Effect of K+Na+/K+ATPase inhibitor on K+concentration in urine and feces of mice

已有研究表示[21]，腸道通透性受損與持續(xù)的腸道癥狀有關(guān)，通透性增加與腹瀉嚴(yán)重程度增加有關(guān)，腸道炎癥會(huì)影響腸道的通透性。本研究發(fā)現(xiàn)，甘草水提物灌胃組的腸道生理狀態(tài)受損，導(dǎo)致腸道免疫屏障受損，腸道通透性增加，而灌胃高劑量甘草水提物導(dǎo)致低鉀血癥，還發(fā)現(xiàn)低鉀血癥是由于胃腸道失鉀造成，其原因可能與腸道通透性的改變有關(guān)。

腸道組織轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果顯示，Na+/K+ATPase在高劑量甘草水提物處理后表達(dá)水平顯著上升，因此在高劑量甘草造模后給予Na+/K+ATPase抑制劑烏苯苷處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠尿液中的K+濃度快速上升，與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明阻斷Na+/K+ATPase活性后小鼠體內(nèi)的鉀離子濃度恢復(fù)，表明低鉀血癥小鼠K+濃度的降低是由腸道Na+/K+ATPase活性增加造成的，阻斷該酶活性，能有效抑制鉀的丟失。在烏苯苷藥效消除之后，造模組小鼠體內(nèi)的K+濃度又隨之降低，進(jìn)一步說明K+的降低是由腸道Na+/K+ATPase造成的。本研究表明高劑量甘草水提物造成低鉀血癥的分子途徑，為臨床研究提供了重要的參考，也為特定條件下需要使用甘草類藥物提供了避免不良低鉀反應(yīng)的治療思路。