張玲，史許鋒，宋婉玉，張展

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是自青春期發(fā)病貫穿女性一生的常見內(nèi)分泌性疾病，具有異質(zhì)、復(fù)雜及進(jìn)行性發(fā)展的特點[1]，其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。臨床上常表現(xiàn)為月經(jīng)異常、不孕、肥胖、痤瘡，未長期管理可導(dǎo)致心血管疾病、代謝性疾病、子宮內(nèi)膜癌變發(fā)生率明顯增高。微小RNA（microRNA，miRNAs）借助對下游靶基因的調(diào)控從而影響卵泡發(fā)育，并在卵巢相關(guān)性疾病中發(fā)揮積極作用。有研究發(fā)現(xiàn)在PCOS患者的卵巢組織、卵泡液及顆粒細(xì)胞中均存在異常表達(dá)的miRNAs，提示miRNAs有望成為PCOS診斷的生物學(xué)標(biāo)志物之一[2]。本研究通過檢測PCOS大鼠血清中miR-200b及靶基因血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)以期為PCOS診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及動物模型的制備取60只6周齡SD雌性大鼠（由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），隨機(jī)分為實驗組、對照組和空白組，每組各20只。將1 mg/（kg·d）來曲唑溶于1%羧甲基纖維素（carboxmethyl cellulose，CMC）中灌胃實驗組大鼠，僅用1%CMC灌胃對照組，均連續(xù)灌服21 d，空白組大鼠正常飲食。每日陰道涂片動態(tài)觀察3組大鼠動情周期變化。

1.2 標(biāo)本采集及處理3組大鼠禁食12 h后缺血法致死，心臟取血5 mL，迅速離心后收集血清，-40℃凍存?zhèn)溆茫?0%甲醛溶液固定大鼠子宮及雙側(cè)卵巢包被蠟塊，待行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。以上實驗均經(jīng)過河南省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)施行。

1.3 血清性激素水平測定采用放射免疫法測定大鼠血清黃體生成激素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）和睪酮（T）水平，試劑盒由天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司提供，質(zhì)量控制符合要求。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）法采用real-time PCR法檢測大鼠血清miR-200b和VEGF的表達(dá)。引物及探針，采用Prime6.0軟件設(shè)計，用Gene Blast進(jìn)行同源檢索后，由上海生工生物工程股份有限公司合成，以β-actin作為內(nèi)參照，嚴(yán)格按照real-time PCR試劑盒檢測說明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度梯度Ct值來設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)曲線；各樣本的拷貝數(shù)通過與其對應(yīng)的內(nèi)參β-actin比較后計算。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCOS大鼠模型鑒定及對比應(yīng)用來曲唑12 d后實驗組大鼠失去規(guī)律的動情周期，取而代之均處于動情間期（大量白細(xì)胞，偶見少量角化上皮細(xì)胞），提示無排卵。而對照組及空白組大鼠鏡下可見規(guī)律的動情周期。見圖1和圖2。

2.2 3組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化實驗組可見大量囊狀擴(kuò)張卵泡，顆粒細(xì)胞層減少至2～3層，各級卵泡和黃體少見甚至消失；對照組和空白組均見到各級發(fā)育的卵泡及黃體，顆粒細(xì)胞多為8～9層。見圖3。

2.3 3組大鼠血清性激素水平變化與對照組、空白組相比，實驗組大鼠血清LH、T水平顯著升高（P＜0.01），血清 FSH、E2、P 水平顯著下降（P＜0.01）。見表1。

2.4 3組大鼠血清中miR-200b及VEGF的表達(dá)與對照組、空白組相比，實驗組大鼠血清miR-200b表達(dá)下降（P＜0.01），VEGF表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見表2。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計全球不孕癥女性中PCOS發(fā)病率為30%～40%，在排卵障礙性不孕者中為75%[3]。臨床在進(jìn)行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕的患者中，PCOS患者存在卵母細(xì)胞成熟度不足、卵子質(zhì)量差等問題，導(dǎo)致胚胎種植潛能明顯低于其他不孕患者[4]。PCOS嚴(yán)重危及女性健康，對其發(fā)生機(jī)制的研究一直是婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的焦點及熱點。

圖1 SD大鼠規(guī)律的動情周期陰道涂片（巴氏染色×400）

圖2 實驗組大鼠動情周期陰道涂片（巴氏染色×400）

圖3 3組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化（HE染色×100）

表1 3組大鼠血清性激素水平比較 （±s）

表1 3組大鼠血清性激素水平比較 （±s）

注：a與對照組比較，P＜0.01；b與空白組比較，P＜0.01。

組別nLH（IU/L）FSH（IU/L）E2（pmol/L）P（nmol/L）T（nmol/L）實驗組 20 7.029±1.087ab 1.995±0.828ab 34.738±4.621ab 22.711±5.340ab 6.977±0.298ab對照組 20 4.905±0.733 2.503±0.705 45.468±6.179 70.938±8.080 2.769±0.127空白組 20 4.729±0.654 2.548±0.449 44.229±5.290 67.263±6.935 2.792±0.146 F 48.704 8.903 25.035 369.340 3 909.560 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表23 組miR-200b及VEGF mRNA水平比較 （±s）

表23 組miR-200b及VEGF mRNA水平比較 （±s）

注：a與對照組比較，P＜0.01；b與空白組比較，P＜0.01。

組別 n miR-200b VEGF實驗組 20 0.913±0.362ab 87.680±32.831ab對照組 20 1.845±0.419 59.517±17.604空白組 20 1.736±0.633 61.421±16.302 F 37.490 11.804 P 0.000 0.000

3.1 來曲唑誘導(dǎo)PCOS大鼠模型的評價因PCOS患者臨床取材較困難，目前有多種造模方法用于PCOS基礎(chǔ)研究以指導(dǎo)臨床治療。本研究依據(jù)雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵性限速酶是芳香化酶這一理論[5]，采用芳香化酶抑制劑——來曲唑方法誘導(dǎo)造模[6]。這種造模方法無論是從大體解剖組織學(xué)改變還是內(nèi)分泌改變均是一種可靠的PCOS動物模型。本實驗復(fù)制的動物模型無論是從大鼠動情周期紊亂、卵巢多囊樣改變，還是大鼠血清性激素水平的變化均與人PCOS患者相似，說明我們的PCOS大鼠模型是制備成功的，也為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)。

3.2 miR-200b與PCOS的關(guān)系目前國內(nèi)外多集中在miR-200b與腫瘤（如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等）的增殖及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等的研究[7]，而關(guān)于miR-200b在PCOS發(fā)病機(jī)制中作用的研究甚少。miR-200b可通過調(diào)節(jié)目的基因Fog2的表達(dá)誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6（IL-6）糖原合成，參與脂代謝，促進(jìn)2型糖尿病和胰島素抵抗的發(fā)生。賈月月等[8]發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中miR-200b異常表達(dá)并與胰島素抵抗有直接相關(guān)性。

3.3 VEGF與PCOS的關(guān)系卵巢血管生成障礙可引起卵巢間質(zhì)、卵泡血管增生，造成卵巢增大并誘發(fā)性激素分泌異常是導(dǎo)致PCOS病情發(fā)展的原因之一。VEGF是血管內(nèi)皮生成因子，通過酪氨酸激酶途徑參與卵巢血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂，促進(jìn)組織血管的形成，提高毛細(xì)血管的通透性，并引起組織血漿蛋白外滲。多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，VEGF通過卵泡內(nèi)的氧化過程，影響卵泡的優(yōu)化及胚胎著床[9]。在PCOS患者卵巢內(nèi)VEGF的異常表達(dá)，引起卵巢間質(zhì)血管增生、擴(kuò)張并出現(xiàn)豐富的血流信號[10]，是最終導(dǎo)致PCOS患者無優(yōu)勢卵泡發(fā)育的重要原因之一。

3.4 miR-200b、VEGF與PCOS的關(guān)系有研究利用熒光素酶活性檢測法驗證了VEGF是miR-200b的下游靶基因，miR-200b可通過直接靶向VEGF，抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長與侵襲[11]。然而VEGF是否是通過miR-200b的調(diào)控在PCOS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，目前國內(nèi)外尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS大鼠血清中miR-200b表達(dá)下調(diào)及靶基因VEGF表達(dá)上調(diào)，分析其原因考慮是由于PCOS血清中miR-200b表達(dá)降低，從而解除了對靶基因VEGF的抑制作用，通過轉(zhuǎn)錄水平導(dǎo)致更多VEGF基因的產(chǎn)生，影響卵泡正常發(fā)育及成熟，最終導(dǎo)致排卵障礙。

綜上所述，PCOS大鼠模型血清中miR-200b與靶基因VEGF異常表達(dá)參與PCOS的發(fā)生、發(fā)展，推測miR-200b可作為PCOS疾病的一種新型非侵入性的診斷標(biāo)志物。然而miRNAs上游及下游調(diào)控通路如何在卵泡發(fā)育、排卵等方面發(fā)揮作用并不完善，仍需進(jìn)一步深入研究，以揭示miRNAs在PCOS中的作用機(jī)制，為今后PCOS的診斷和治療提供新的依據(jù)和治療靶點。