唐 密，鄭 紅，馬 良，戴宏杰，郭 婷，周鴻媛，余 永，張宇昊*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

鱔魚(yú)（Monopterus albus）是一種蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低的典型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，廣受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。鱔魚(yú)除營(yíng)養(yǎng)豐富外，還具有較高的藥用價(jià)值，是整個(gè)亞洲最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的淡水養(yǎng)殖魚(yú)之一[2]。據(jù)報(bào)道，近年來(lái)我國(guó)市場(chǎng)每年對(duì)鱔魚(yú)的需求量達(dá)300萬(wàn) t[3]，很多餐飲企業(yè)直接買(mǎi)入鱔魚(yú)肉冷藏待加工，很多超市都在流通售賣(mài)冷藏調(diào)制鱔魚(yú)肉制品。但魚(yú)肉在宰殺后以及冷藏過(guò)程中，由于微生物、內(nèi)源性酶、蛋白質(zhì)降解和變性等作用，其品質(zhì)和食用價(jià)值均會(huì)降低[4-5]。因此，研究不同新鮮度鱔魚(yú)肉品質(zhì)變化規(guī)律具有重要意義。

魚(yú)肉在貯藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生劣變，進(jìn)而影響其熟化后的品質(zhì)，而魚(yú)肉熟化后的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)是加熱過(guò)程中蛋白經(jīng)過(guò)一系列變化而形成的。Dima[6]、Verhaeghe[7]等研究證明，魚(yú)肉在加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)的變性聚集是蒸煮損失和品質(zhì)形成的主要原因。曹雷鵬等[8]研究發(fā)現(xiàn)草魚(yú)在熱加工過(guò)程中，其肉色逐漸變白，蒸煮損失率、收縮面積比和色差ΔE值均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢下降?？姾氐萚9]研究表明，蛋白質(zhì)的分解主要是由于魚(yú)肉中內(nèi)源性酶和微生物的作用，魚(yú)肉蛋白結(jié)構(gòu)更易改變，使得冷藏時(shí)間越長(zhǎng)的魚(yú)肉其蛋白在加熱過(guò)程中收縮得越強(qiáng)烈，進(jìn)而造成蒸煮后魚(yú)肉的水分含量、硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性都呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，失水率和質(zhì)量損失率呈顯著上升趨勢(shì)，從而證實(shí)了加熱前金槍魚(yú)肉的蛋白存在狀態(tài)（即魚(yú)肉新鮮度）會(huì)在一定程度上影響熟化后魚(yú)肉品質(zhì)。因此，魚(yú)肉熟化后的品質(zhì)實(shí)際上同其加熱前魚(yú)肉蛋白的存在狀態(tài)有關(guān)，即與魚(yú)肉的新鮮度相關(guān)。

前期研究表明，鱔魚(yú)肉冷藏貨架期為4 d，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，鱔魚(yú)肉蛋白間主要內(nèi)部作用力被破壞，蛋白結(jié)構(gòu)逐漸松散，蛋白質(zhì)開(kāi)始降解，導(dǎo)致鱔魚(yú)肉品質(zhì)逐漸劣變；不同新鮮度鱔魚(yú)肉熟化后其持水性降低，彈性、咀嚼性和回復(fù)性呈不同變化趨勢(shì)，主要是由于鱔魚(yú)肉熟化后蛋白價(jià)鍵發(fā)生變化，蛋白無(wú)序化程度增加，蛋白空間結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而造成不同貯藏時(shí)間的熟化鱔魚(yú)肉品質(zhì)劣變[10-11]。由此可見(jiàn)，不同新鮮度鱔魚(yú)肉中蛋白結(jié)構(gòu)的差異性導(dǎo)致了熟化后鱔魚(yú)肉品質(zhì)差異的產(chǎn)生。因此，有必要對(duì)不同新鮮度鱔魚(yú)肉加熱過(guò)程中品質(zhì)產(chǎn)生差異的原因進(jìn)行系統(tǒng)研究，以明確鱔魚(yú)肉品質(zhì)變化和蛋白結(jié)構(gòu)變化在貯藏期間與熟化后之間的關(guān)系。

本研究主要通過(guò)測(cè)定貨架期內(nèi)不同新鮮度鱔魚(yú)肉加熱過(guò)程的品質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)變化，分析不同新鮮度鱔魚(yú)肉加熱過(guò)程中品質(zhì)形成差異的原因，為明確貨架期內(nèi)不同新鮮度鱔魚(yú)肉熟化后品質(zhì)劣變機(jī)制及相關(guān)制品研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱔魚(yú)購(gòu)自北碚區(qū)天生菜市場(chǎng)，體長(zhǎng)30 cm左右，質(zhì)量60～70 g。

鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、無(wú)水乙醇、尿素成都市科龍化工試劑廠；過(guò)硫酸銨、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺、考馬斯亮藍(lán)R-250 美國(guó)Bio Basic公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 天津市鑫源化工有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的丙烯酰胺工作液 北京索萊寶科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子質(zhì)量10～200 kDa） 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。其中Tris、考馬斯亮藍(lán)R-250、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%丙烯酰胺工作液為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA3003B電子天平 上海精天電子儀器有限公司；QL901漩渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；8002型溫控水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器廠；DGG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；G:BOX EF型凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司；5810型臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 魚(yú)肉處理

參照鄭紅等[11]的方法處理新鮮鱔魚(yú)。分別取4 ℃條件下貯藏第1、2、3、4、5天的鱔魚(yú)肉樣品（揮發(fā)性鹽基氮含量分別為10.47、11.52、12.13、14.08、16.49 mg/100 g[10]），并分別在100 ℃條件下加熱0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 min，自然冷卻后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 蒸煮失水率的測(cè)定

將加熱（100 ℃、5 min）前后的鱔魚(yú)肉分別絞碎，蒸煮失水率的測(cè)定參照鄭紅等[11]的方法進(jìn)行，按下式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 化學(xué)作用力的測(cè)定

參照鄭紅等[11]的方法測(cè)定化學(xué)作用力。以蛋白相對(duì)含量表示。

1.3.4 TCA-可溶性氮含量的測(cè)定

樣品處理參考Benjakul等[12]的方法并稍有改動(dòng)。取鱔魚(yú)肉3.0 g，加入27 mL 5% TCA溶液，均質(zhì)2 min后冰浴1 h，5 000×g、4 ℃條件下離心5 min并取上清液。通過(guò)Lowry法[13]測(cè)定TCA-可溶性氮含量，以每克魚(yú)肉中酪氨酸的物質(zhì)的量表示TCA-可溶性氮含量。

1.3.5 電泳分析

電泳膠的制備參照楊暉等[14]的方法進(jìn)行，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠，按鄭紅等[11]的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理并電泳。用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖，再通過(guò)Gene Tools分析結(jié)果。

1.3.6 拉曼光譜分析

拉曼光譜測(cè)量條件與測(cè)定步驟參照鄭紅等[11]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用SPSS 19.0軟件的Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，并用Origin 9.0軟件作圖。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱔魚(yú)肉新鮮度對(duì)加熱過(guò)程中蒸煮失水率的影響

圖1 冷藏時(shí)間和加熱時(shí)間對(duì)鱔魚(yú)肉蒸煮失水率的影響Fig. 1 Effect of refrigeration time and heating time on moisture loss of Monopterus albus

由圖1可知，鱔魚(yú)肉蒸煮失水率隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)而增加。貯藏時(shí)間越長(zhǎng)的鱔魚(yú)肉，加熱過(guò)程中失水越嚴(yán)重。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鱔魚(yú)肉部分蛋白會(huì)發(fā)生降解，使鱔魚(yú)肉自身持水性變差[10]，從而導(dǎo)致加熱過(guò)程中鱔魚(yú)肉蒸煮失水率增加；此外，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鱔魚(yú)肉蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)[15]，也會(huì)導(dǎo)致加熱過(guò)程中蛋白收縮更加強(qiáng)烈進(jìn)而造成失水更加嚴(yán)重。Cao Leipeng[16]、Shi Ce[17]等研究表明，隨貯藏時(shí)間和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)肉蒸煮失水率呈上升趨勢(shì)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2 鱔魚(yú)肉新鮮度對(duì)加熱過(guò)程中化學(xué)作用力的影響

圖2 不同冷藏時(shí)間鱔魚(yú)肉加熱過(guò)程中化學(xué)作用力的變化Fig. 2 Changes in chemical forces of Monopterus albus proteins as affected by storage time and cooking time

新鮮鱔魚(yú)蛋白空間結(jié)構(gòu)的主要作用力為離子鍵和氫鍵，其含量在貯藏過(guò)程中隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，疏水相互作用和二硫鍵含量逐漸增加[10]。由圖2A、B可知，離子鍵和氫鍵隨加熱的進(jìn)行而逐漸被破壞，熟化鱔魚(yú)肉中蛋白間相互作用以疏水相互作用為主。由圖2C可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，新鮮的鱔魚(yú)肉（貯藏1～2 d）疏水相互作用含量逐漸增加，但貯藏時(shí)間較長(zhǎng)的鱔魚(yú)肉中疏水相互作用含量則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樾迈r鱔魚(yú)肉中蛋白展開(kāi)程度低，加熱過(guò)程中蛋白逐漸展開(kāi)，疏水基團(tuán)充分暴露，疏水相互作用含量逐漸增加[18-20]；而貯藏時(shí)間較長(zhǎng)的鱔魚(yú)肉中蛋白展開(kāi)程度較高，加熱過(guò)程前期，蛋白肽鏈已經(jīng)充分展開(kāi)，疏水作用達(dá)到最大值，后期在熱力作用下部分疏水作用被破壞，導(dǎo)致疏水作用下降[21]。疏水作用的降低說(shuō)明蛋白間相互作用力下降，這可能會(huì)導(dǎo)致魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)特性下降[11,22-24]。

由圖2D可知，新鮮的鱔魚(yú)肉（貯藏1～3 d），在加熱初始，二硫鍵含量上升，隨著加熱的繼續(xù)進(jìn)行變化不大，而貯藏時(shí)間較長(zhǎng)（4～5 d）的鱔魚(yú)肉在加熱后期二硫鍵含量降低，這可能是因?yàn)榈鞍壮浞终归_(kāi)后二硫鍵被熱力破壞。本課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，二硫鍵含量同熟化鱔魚(yú)肉的口感高度相關(guān)，因此，貯藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的鱔魚(yú)肉可能會(huì)在加熱過(guò)程中因二硫鍵被破壞而口感下降。對(duì)于貯藏時(shí)間較長(zhǎng)的鱔魚(yú)肉，在保證微生物安全的前提下，適當(dāng)?shù)乜s短加熱時(shí)間可以改善鱔魚(yú)肉的口感。

2.3 鱔魚(yú)肉新鮮度對(duì)加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的影響

圖3 不同冷藏時(shí)間鱔魚(yú)肉加熱過(guò)程中TCA-可溶性氮含量（A）和全蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖（B）的變化Fig. 3 Change in TCA-soluble nitrogen (A) and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of total protein (B) of Monopterus albus as affected by storage time and cooking time

由圖3A可知，不同新鮮度鱔魚(yú)肉TCA-可溶性氮含量在加熱過(guò)程中變化不大，說(shuō)明加熱過(guò)程并未明顯造成鱔魚(yú)肉中蛋白質(zhì)的降解。貯藏時(shí)間越長(zhǎng)的生鱔魚(yú)肉，TCA-可溶性氮含量越高，說(shuō)明蛋白降解越嚴(yán)重，且這一現(xiàn)象并未隨著加熱的進(jìn)行而改變。

由圖3B可知，加熱過(guò)程中，鱔魚(yú)肉蛋白圖譜沒(méi)有明顯的蛋白條帶加深或變淡，進(jìn)一步說(shuō)明加熱沒(méi)有造成蛋白明顯降解。貯藏2～5 d的樣品中，觀察到一條分子質(zhì)量約30 kDa的蛋白條帶，且隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，其蛋白條帶顏色加深，結(jié)合TCA-可溶性氮含量結(jié)果，說(shuō)明該組分可能是貯藏過(guò)程中的蛋白降解產(chǎn)物。

2.4 拉曼光譜分析

2.4.1 蛋白質(zhì)微環(huán)境的變化

如圖4所示，拉曼光譜中760 cm-1譜峰是關(guān)于色氨酸環(huán)的伸縮振動(dòng)，當(dāng)包埋在疏水微環(huán)境中的色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境時(shí)，760 cm-1處峰強(qiáng)度下降[25]。而被稱(chēng)為費(fèi)米共振雙峰的850 cm-1和830 cm-1譜峰與酪氨酸殘基對(duì)位取代苯振動(dòng)有關(guān)，采用I850/I830以表征酪氨酸殘基的暴露與包埋情況，當(dāng)I850/I830的比值為0.9～2.5時(shí)表明酪氨酸殘基暴露[26]。由表1可知，在加熱過(guò)程中，I760從加熱1 min開(kāi)始下降（P＜0.05），I850/I830的比值隨加熱的進(jìn)行呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)（P＜0.05），說(shuō)明加熱會(huì)促進(jìn)色氨酸、酪氨酸殘基暴露[27-28]。加熱初期的鱔魚(yú)肉，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，I760和I850/I830的比值無(wú)顯著變化（P＞0.05）；而加熱后期，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，I760顯著增加（P＜0.05），I850/I830的比值呈先增加后下降的趨勢(shì)（P＜0.05），說(shuō)明隨著魚(yú)肉新鮮度降低，加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致暴露的色氨酸、酪氨酸殘基重新被包埋。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)中化學(xué)作用力的變化，說(shuō)明隨著蛋白鏈之間化學(xué)相互作用力降低，蛋白構(gòu)象更容易改變；同時(shí)，鱔魚(yú)肉新鮮度越低，其降解程度越高。因此，貯藏時(shí)間較長(zhǎng)的鱔魚(yú)肉在加熱后期肽鏈的改變向親水基團(tuán)暴露、疏水基團(tuán)被包埋的趨勢(shì)發(fā)展，這與疏水作用的降低趨勢(shì)一致。

圖4 不同冷藏時(shí)間鱔魚(yú)肉加熱過(guò)程中的拉曼光譜（500～2 000 cm-1）Fig. 4 Raman spectra in 500-2 000 cm-1 region of Monopterus albus proteins as affected by storage time and cooking time

表1 不同冷藏時(shí)間鱔魚(yú)熟化過(guò)程中I760和I850/I830比值歸一化強(qiáng)度的變化Table 1 Changes in normalized I760 and I850/I830 ratio in Raman spectroscopic analysis of Monopterus albus proteins as affected by storage time and cooking time

2.4.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

圖5 不同冷藏時(shí)間鱔魚(yú)加熱過(guò)程中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Fig. 5 Changes in contents of secondary structures in Monopterus albus protein as affected by storage time and cooking time

酰胺I帶（1 640～1 680 cm-1）主要源于肽鍵C＝O的面內(nèi)伸縮振動(dòng)及N—H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，常常被用來(lái)估算蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息[29]。酰胺I帶拉曼光譜峰的結(jié)構(gòu)主要由1 645～1 660 cm-1（α-螺旋）、1 660～1 665 cm-1（無(wú)規(guī)卷曲）、1 665～1 680 cm-1（β-折疊）和1 680 cm-1附近（β-轉(zhuǎn)角）等重疊的譜帶構(gòu)成[30]。各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化情況通過(guò)對(duì)酰胺I帶的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行去卷積和高斯擬合得到。由圖5可知，貯藏1～5 d內(nèi)，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，肽鏈逐漸解旋，無(wú)規(guī)卷曲含量增加，蛋白結(jié)構(gòu)逐漸向無(wú)序化轉(zhuǎn)變。貯藏時(shí)間越長(zhǎng)的鱔魚(yú)肉，加熱過(guò)程中蛋白展開(kāi)程度越大，這可能是因?yàn)樯r鱔魚(yú)肉中蛋白展開(kāi)程度較高，加熱過(guò)程中魚(yú)肉蛋白逐漸展開(kāi)，蛋白結(jié)構(gòu)緊密程度和構(gòu)象穩(wěn)定性明顯降低，蛋白無(wú)序化程度增加，從而導(dǎo)致α-螺旋和β-折疊逐漸轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲[31-32]。加熱5 min時(shí)，貯藏5 d的鱔魚(yú)肉α-螺旋含量高于貯藏4 d，說(shuō)明貯藏5 d的鱔魚(yú)肉在加熱后期蛋白結(jié)構(gòu)傾向于有序化，這可能是其加熱后期部分肽鏈形成了一定的空間結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

鱔魚(yú)肉蒸煮失水率隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)而增加。貯藏時(shí)間越長(zhǎng)的鱔魚(yú)肉，加熱過(guò)程中失水越嚴(yán)重；鱔魚(yú)肉中離子鍵和氫鍵隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸被破壞；新鮮鱔魚(yú)肉（1～2 d）在加熱過(guò)程中，疏水相互作用含量逐漸增加，二硫鍵含量在加熱初期增加，后期則變化不大；貯藏時(shí)間較長(zhǎng)的鱔魚(yú)肉（3～5 d），在加熱過(guò)程中疏水相互作用含量則總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，二硫鍵含量在加熱前期變化不大，加熱后期則降低；不同新鮮度的鱔魚(yú)肉在加熱過(guò)程中蛋白均未發(fā)生明顯降解，熟化鱔魚(yú)肉中蛋白降解程度的差異主要由貯藏過(guò)程中蛋白降解造成；新鮮度越低的鱔魚(yú)肉，加熱過(guò)程中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)程度越高，且在加熱后期隨著鱔魚(yú)肉新鮮度降低，更多暴露的色氨酸、酪氨酸殘基重新被包埋，導(dǎo)致了疏水作用降低。