魏 俊，趙范范，劉馨君，勞鳳學(xué)，黃漢昌，商迎輝*

（北京市生物活性物質(zhì)和功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

近年來，隨全球老齡化形勢的加劇，阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）作為一種高發(fā)態(tài)勢的神經(jīng)退行性疾病引起社會(huì)各屆廣泛關(guān)注[1-4]。AD的病理機(jī)制眾多，其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）被認(rèn)為在AD的形成及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡中具有重要作用[5-6]。ERS是生物體內(nèi)錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)數(shù)量增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)負(fù)荷加大、內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)的一種應(yīng)激性反應(yīng)[7-8]。短期的ERS誘發(fā)細(xì)胞的未折疊蛋白應(yīng)答（unfolded-protein response，UPR）反應(yīng)，可促進(jìn)異常折疊蛋白質(zhì)的降解，是細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制[9]，而長期過度的ERS則使細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)難以恢復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10-11]，大腦神經(jīng)元缺失是促進(jìn)AD病理的形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。近期研究顯示，ERS過度反應(yīng)可激活γ-裂解酶，繼而引起β-淀粉樣蛋白水平升高，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]。因此，尋找合適的藥物或者生物活性物質(zhì)抑制ERS反應(yīng)，提高細(xì)胞的存活率可作為治療AD的新方向。

圖1 玉米黃素的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 Molecular structure of zeaxanthin

玉米黃素（zeaxanthin）是一種類胡蘿卜素，具有保護(hù)視力、預(yù)防心血管疾病、抗衰老及增強(qiáng)免疫力等功效[13-14]。此外，最新研究從分子結(jié)構(gòu)（圖1）上指出類胡蘿卜素等存在酮κ-環(huán)和β-環(huán)（如玉米黃素）的理化性質(zhì)，可能防止β-淀粉樣蛋白的聚集，因此，玉米黃素等類胡蘿卜素可能有治療AD的潛力[15]。衣霉素（tunicamycin，TM）是一種天然抗生素，已在體外實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16-19]，激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)隨后可觸發(fā)細(xì)胞的凋亡通路，促使細(xì)胞死亡[20]。SH-SY5Y細(xì)胞為神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，廣泛用于神經(jīng)退行性疾病細(xì)胞模型的建立[21]。本實(shí)驗(yàn)用TM處理創(chuàng)建SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型，用不同濃度的玉米黃素對(duì)損傷模型進(jìn)行預(yù)處理或后處理，測定細(xì)胞存活率和細(xì)胞毒性，來研究玉米黃素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為開發(fā)玉米黃素的功能性食品及AD等神經(jīng)退行性疾病的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃素（純度為85.7%，高效液相色譜法鑒定，臨用時(shí)用無水乙醇溶解成30 mmol/L的儲(chǔ)存液） 上海源葉生物科技有限公司。

SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；RPMI 1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司；胎牛血清、胰酶 美國Hyclone公司；雙抗（青霉素-鏈霉素） 北京Solarbio公司；TM（采用二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶解，配制成10 μg/μL的儲(chǔ)存液，-20 ℃保存，應(yīng)用時(shí)采用培養(yǎng)基稀釋至所需終質(zhì)量濃度） 北京華越洋生物科技有限公司；噻唑藍(lán)美國Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀、ND-1000型紫外-可見分光光度計(jì) 美國賽默飛世爾科技公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；E191IR型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱美國金西盟公司。

1.3 方法

1.3.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞復(fù)蘇后于37 ℃、5% CO2條件下用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代，根據(jù)細(xì)胞的生長速度定時(shí)更換培養(yǎng)液，加藥時(shí)換成不含血清的培養(yǎng)液。

1.3.2 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型的建立

取對(duì)數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，胰酶消化后按1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到貼壁狀態(tài)時(shí)，棄去上清液，加入由RPMI 1640培養(yǎng)基配制成的不同濃度梯度的TM溶液，每個(gè)梯度8 個(gè)平行。TM培養(yǎng)36 h后，進(jìn)行檢測，以此來確定TM損傷的最佳處理濃度。

1.3.3 玉米黃素處理及分組

細(xì)胞培養(yǎng)過程同1.3.1節(jié)，得出TM最佳損傷濃度和時(shí)間后，用此濃度建立細(xì)胞損傷模型。玉米黃素處理及分組：空白組（不做處理）、損傷組（僅TM處理）、玉米黃素保護(hù)組（玉米黃素預(yù)處理及后處理）。玉米黃素預(yù)處理組使用2、5、10、15、20、100 μmol/L的玉米黃素預(yù)處理一定時(shí)間后加TM處理36 h，以此篩選玉米黃素的最佳作用濃度，后續(xù)用濃度為2、5、10 μmol/L的玉米黃素預(yù)處理1、2、3、4、5、6、12、24 h后檢測細(xì)胞存活率。玉米黃素后處理組先用TM處理30 min，再加不同濃度的玉米黃素處理24 h后進(jìn)行檢測。

1.3.4 細(xì)胞活性檢測

取對(duì)數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，胰酶消化后按1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h，經(jīng)分組處理后，每孔加入噻唑藍(lán)溶液使其終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150～200 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。放入酶標(biāo)儀，于570 nm波長處測定OD值，按公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 細(xì)胞毒性檢測

取對(duì)數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，胰酶消化后按1×105個(gè)/孔接種于24 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到貼壁狀態(tài)時(shí)，棄去上清液，細(xì)胞玉米黃素處理及損傷模型建立同1.3.3節(jié)。吸取各組培養(yǎng)液20 μL，用LDH試劑盒進(jìn)行檢測?？瞻捉M細(xì)胞用3%的Triton X-100裂解后測定LDH活力。LDH釋放率按公式（3）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測定數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0和Origin 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用單因素方差分析并用Bonferroni法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TM損傷濃度的篩選

圖2 不同質(zhì)量濃度的TM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響Fig. 2 Dose-dependent effect of TM on the viability of SH-SY5Y cells

SH-SY5Y細(xì)胞用不同濃度的TM溶液培養(yǎng)36 h，由圖2可知，不同質(zhì)量濃度TM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的生長均有一定抑制作用，且細(xì)胞存活率隨TM質(zhì)量濃度的升高呈下降趨勢。與空白組相比，TM質(zhì)量濃度為2 μg/mL時(shí)開始出現(xiàn)極顯著抑制作用（P＜0.01），當(dāng)TM質(zhì)量濃度為4、6 μg/mL時(shí)，SH-SY5Y細(xì)胞的存活率分別為68.97%和47.73%，因此可選擇兩者的中間質(zhì)量濃度5 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的損傷處理質(zhì)量濃度。當(dāng)TM質(zhì)量濃度太低時(shí)，不能有效抑制細(xì)胞增殖，而TM質(zhì)量濃度過高則會(huì)引起細(xì)胞死亡過量，因此建立細(xì)胞損傷模型時(shí)，選用5 μg/mL TM處理36 h。

2.2 玉米黃素濃度的篩選

玉米黃素是含紫羅酮環(huán)的二羥基類胡蘿卜素，它的兩個(gè)紫羅酮環(huán)都是β型，C5和C6間的β-紫羅酮環(huán)雙鍵與共軛多烯鏈結(jié)合在一起（圖1），這種結(jié)構(gòu)可能防止形成β-淀粉樣蛋白聚集，具有治療AD的潛力。為檢測玉米黃素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用，用不同濃度的玉米黃素預(yù)處理6 h后再加入5 μg/mL TM。由圖3可知，2、5、10 μmol/L的玉米黃素預(yù)處理組細(xì)胞存活率均高于TM損傷組，其中5 μmol/L時(shí)存活率顯著升高（P＜0.05），但玉米黃素濃度為20 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率（65.20%）低于損傷組（70.75%），且玉米黃素濃度為100 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率極顯著低于損傷組（P＜0.01）。說明玉米黃素濃度過高對(duì)細(xì)胞會(huì)有損傷作用，因此，選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)的玉米黃素濃度為2、5、10 μmol/L，5 μmol/L最佳。

圖3 不同濃度玉米黃素預(yù)處理對(duì)TM引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響Fig. 3 Dose-dependent effect of zeaxanthin on cell viability of SH-SY5Y cells damaged by TM

2.3 玉米黃素預(yù)處理對(duì)細(xì)胞活性的影響

圖4 玉米黃素預(yù)處理時(shí)間對(duì)TM引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響Fig. 4 Effect of pretreatment time of zeaxanthin on cell viability of SH-SY5Y cells damaged by TM

如圖4A所示，玉米黃素預(yù)處理1、2 h的細(xì)胞存活率與TM損傷組相比無明顯變化（P＞0.05），由圖4B可知，玉米黃素預(yù)處理3、4 h后細(xì)胞存活率高于TM損傷組，其中預(yù)處理4 h有顯著性差異（P＜0.05），圖4C中，玉米黃素預(yù)處理5、6 h后細(xì)胞存活率均顯著高于TM損傷組（P＜0.05），其中預(yù)處理6 h的保護(hù)作用更加明顯（P＜0.01）。由圖4D可知，與TM損傷組相比，玉米黃素預(yù)處理12 h后細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05），與預(yù)處理6 h組一樣，當(dāng)玉米黃素濃度為5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率的升高具有極顯著差異（P＜0.01），預(yù)處理12 h后的細(xì)胞存活率開始下降。因此，玉米黃素預(yù)處理的時(shí)長對(duì)細(xì)胞活性也有一定的影響，預(yù)處理時(shí)長為4～12 h，玉米黃素（5 μmol/L）均能緩解TM導(dǎo)致的細(xì)胞存活率降低作用，其中玉米黃素5 μmol/L預(yù)處理6 h效果最為顯著。

2.4 玉米黃素后處理對(duì)細(xì)胞活性的影響

圖5 玉米黃素后處理對(duì)TM引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響Fig. 5 Effect of post-treatment time of zeaxanthin on cell viability of SH-SY5Y cells damaged by TM

2.3節(jié)結(jié)果顯示玉米黃素能緩解TM導(dǎo)致的細(xì)胞存活率的降低，為探究玉米黃素能否逆轉(zhuǎn)TM引起的細(xì)胞損傷，SH-SY5Y細(xì)胞先用5 μg/mL TM培養(yǎng)30 min，再用2、5、10 μmol/L的玉米黃素后處理24 h，存活率檢測結(jié)果顯示，單獨(dú)TM損傷30 min的細(xì)胞存活率下降了14.1%（P＜0.001），而玉米黃素后處理組的細(xì)胞存活率均顯著高于損傷組（P＜0.05）（圖5）。此結(jié)果說明，玉米黃素不僅能減輕TM引起的細(xì)胞損傷作用，并且在一定程度上可逆轉(zhuǎn)TM引起的損傷。

2.5 玉米黃素預(yù)處理對(duì)細(xì)胞毒性的影響

圖6 玉米黃素預(yù)處理對(duì)TM引起的SH-SY5Y細(xì)胞LDH活力的影響Fig. 6 Effect of pretreatment of zeaxanthin on LDH activity of SH-SY5Y cells damaged by TM

細(xì)胞損傷而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致胞漿內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)液中，因此檢測培養(yǎng)液中的LDH活力，就可以反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和損傷程度，用于細(xì)胞毒性的檢測。由圖6可知，TM損傷處理后，胞漿內(nèi)LDH的釋放率（培養(yǎng)液中的LDH活力）較空白組極顯著增加（P＜0.01）。之前結(jié)果顯示預(yù)處理6 h對(duì)細(xì)胞存活率的保護(hù)作用最佳，因此選用玉米黃素的預(yù)處理時(shí)間為6 h。與損傷組相比，2、10 μmol/L玉米黃素預(yù)處理組LDH釋放率均降低（P＜0.05），5 μmol/L處理組LDH釋放率極顯著低于損傷組（P＜0.01），說明玉米黃素能拮抗TM對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的應(yīng)激損傷。

2.6 玉米黃素后處理對(duì)細(xì)胞毒性的影響

圖7 玉米黃素后處理對(duì)TM引起的SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放率的影響Fig. 7 Effect of post-treatment of zeaxanthin on LDH activity of SH-SY5Y cells damaged by TM

SH-SY5Y細(xì)胞先用5 μg/mL TM培養(yǎng)30 min，再用2、5、10 μmol/L的玉米黃素后處理，24 h后檢測LDH的釋放量。如圖7所示，與空白培養(yǎng)液組相比，TM損傷組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH釋放率顯著升高（P＜0.05），表明TM使細(xì)胞受損引起了LDH外漏。與TM損傷組相比，玉米黃素各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH釋放率有所下降，其中2、5 μmol/L玉米黃素后處理組下降顯著（P＜0.05），表明玉米黃素后處理可以減緩細(xì)胞膜受損程度，阻止細(xì)胞內(nèi)LDH外漏。10 μmol/L玉米黃素處理后LDH的釋放率較損傷組雖有下降，但無顯著性差異。

3 討 論

AD作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，已經(jīng)與腦卒中、腫瘤、心腦血管病相匹敵，成為老年人的第四大殺手[22-23]。近幾十年來，關(guān)于AD的藥物開發(fā)及臨床治療成果甚微，并且由于AD發(fā)病時(shí)間晚，目前尚無明確的特異性指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行檢測，容易錯(cuò)過最佳治療時(shí)期，因此目前對(duì)于AD的研究已經(jīng)逐漸從治療到預(yù)防的方向轉(zhuǎn)變[24-25]，對(duì)AD的早期預(yù)防成為焦點(diǎn)。營養(yǎng)學(xué)上認(rèn)為早期補(bǔ)充含有益生物活性物質(zhì)的膳食有助于預(yù)防AD[26]；病理學(xué)方面，在AD患者大腦未出現(xiàn)病理狀態(tài)的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)ERS的標(biāo)志蛋白表達(dá)增多的現(xiàn)象[27]，這說明ERS發(fā)生于AD的早期階段。此外ERS會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，過氧化物增多等一系列生理功能的變化，還能激活UPR的凋亡信號(hào)通路，在AD的形成及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡中具有重要作用。因此，尋找合適的生物活性物質(zhì)抑制ERS反應(yīng)對(duì)AD的早期控制和病理抑制具有重要意義。

最新研究表明類胡蘿卜素可在治療神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮有益作用[28-29]，指出玉米黃素可能具有抗β-淀粉樣蛋白聚集的作用，并且對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有一定的緩解作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，玉米黃素能夠緩解高糖引起的小鼠認(rèn)知功能的損傷[30-31]。結(jié)合以上研究，推測玉米黃素可能具備預(yù)防和治療AD的潛力。

本實(shí)驗(yàn)通過TM誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷來建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型，以此探究玉米黃素在AD治療中的潛力。結(jié)果表明，TM濃度為5 μmol/L時(shí)，能夠?qū)H-SY5Y細(xì)胞造成有效的損傷。TM能夠抑制細(xì)胞內(nèi)合成N寡聚糖的第一步反應(yīng)，從而阻止蛋白質(zhì)的成熟，并引起ERS，長期過度的ERS使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷加大，引起細(xì)胞死亡。研究顯示，2～10 μmol/L玉米黃素能夠減輕TM的損傷作用，提高細(xì)胞存活率，降低LDH的釋放率，并且在一定程度上可逆轉(zhuǎn)TM引起的損傷。預(yù)處理時(shí)間的研究表明，一定濃度的玉米黃素預(yù)處理時(shí)長在4～12 h時(shí)可以有效緩解TM引起的細(xì)胞死亡，且當(dāng)玉米黃素濃度為5 μmol/L，預(yù)處理6 h時(shí)保護(hù)效果最好。本實(shí)驗(yàn)表明，玉米黃素可有效改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷并維持細(xì)胞膜的完整性。但玉米黃素能否改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的其他變化，如細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞核的形態(tài)變化仍需進(jìn)一步探索，且玉米黃素究竟通過哪一通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激尚不明確，還需進(jìn)一步研究。