姜陳波，杭 鋒*

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）可作為生物催化劑水解乳糖，廣泛應(yīng)用于乳品加工、食品加工、制藥領(lǐng)域等[1]。除了水解反應(yīng)以外，具有轉(zhuǎn)糖基活力的β-gal還能參與轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，產(chǎn)生益生元低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）[2]。GOS因其具有顯著調(diào)節(jié)腸道菌群、提高有益菌雙歧桿菌的數(shù)量和代謝活力、減少有害菌吸附、調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)以及治療代謝疾病的作用，在益生元領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注[3]。

商業(yè)GOS一般以乳糖為底物，通過β-gal轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，產(chǎn)生具有不同聚合度和糖苷鍵的復(fù)雜GOS混合物，該過程依賴于酶的來源和作用條件[4]。β-gal在自然界中普遍存在，其來源包括動(dòng)物、植物和微生物，一般而言微生物來源β-gal的生產(chǎn)率更高，可以顯著降低生產(chǎn)成本[5]。因此，盡管在多種來源中發(fā)現(xiàn)β-gal，仍普遍采用微生物源β-gal合成GOS[6]。微生物源β-gal包括曲霉屬（Aspergillus）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）、乳桿菌屬（Lactobacillus）以及雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等，這些來源的β-gal已作為生物催化劑應(yīng)用于GOS的合成反應(yīng)[7]。

在多種微生物源β-gal中，Aspergillus和Kluyveromyces菌株產(chǎn)生的β-g a l在工業(yè)中應(yīng)用范圍最廣[8]。但雙歧桿菌（bifidobacteria）和乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）來源的β-gal在生產(chǎn)GOS方面也具有非常重要的價(jià)值，是β-gal較好的來源，且越來越受到關(guān)注。首先雙歧桿菌和LAB均被認(rèn)為是“一般認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）”的微生物，在食品發(fā)酵領(lǐng)域具有較長(zhǎng)的應(yīng)用歷史。此外，研究發(fā)現(xiàn)利用乳酸菌β-半乳糖苷酶（lactic acid bacteria β-galactosidase，Lβ-gal）和雙歧桿菌β-半乳糖苷酶（bifidobacteria β-galactosidase，Bβ-gal）合成的GOS將最有可能選擇性促進(jìn)這兩類菌在腸道中的生長(zhǎng)，提高菌株在腸道內(nèi)的代謝活力，從而增加益生作用[9]。

近年來，國(guó)內(nèi)關(guān)于β-gal的綜述性報(bào)道較少，國(guó)外則較為全面[1,5]，但針對(duì)Lβ-gal和Bβ-gal這兩類來源及其合成GOS的總結(jié)報(bào)道較少。因此，本文針對(duì)Lβ-gal和Bβ-gal轉(zhuǎn)糖基作用合成GOS的研究進(jìn)展，總結(jié)了能夠產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)糖基活力β-gal的雙歧桿菌和乳酸菌菌株，分析比較了兩類來源的β-gal的酶學(xué)性質(zhì)，并重點(diǎn)闡明了β-gal以乳糖為底物在合成GOS中的應(yīng)用，為開發(fā)Lβ-gal和Bβ-gal及其應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 β-gal轉(zhuǎn)糖基作用合成GOS

近年來，GOS因其具有多種益生功能，且在較廣的pH值和溫度范圍內(nèi)具有穩(wěn)定性，而受到廣泛關(guān)注[10]。GOS的分子鏈含有2～8 個(gè)單糖，末端為1 個(gè)葡萄糖分子，剩余部分為半乳糖；此外，通過轉(zhuǎn)糖基作用由2 個(gè)半乳糖組成的二糖也屬于GOS[6]。GOS被認(rèn)為是具有有益作用的益生元成分，可不被水解或消化直接從人體上腸道到達(dá)大腸，選擇性促進(jìn)腸道中有益菌雙歧桿菌和乳桿菌的生長(zhǎng)，以及抑制腸道致病菌的生長(zhǎng)[11]，從而改善腸道菌群的組成，對(duì)免疫反應(yīng)和代謝綜合征標(biāo)志物產(chǎn)生積極作用[12-14]。此外，腸道微生物在結(jié)腸中發(fā)酵GOS的產(chǎn)物包括乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等短鏈脂肪酸，這些產(chǎn)物給結(jié)腸上皮提供能量，降低了結(jié)腸pH值，促進(jìn)了鈣、鎂的吸收，以及降低了促炎反應(yīng)標(biāo)志物的水平[15-17]。

目前，主要通過糖苷水解酶的轉(zhuǎn)糖基作用，以乳糖為底物，產(chǎn)生具有不同聚合度和結(jié)構(gòu)的GOS混合物以及未參與反應(yīng)的乳糖和單糖（葡萄糖和半乳糖）[18]。在GOS的工業(yè)化生產(chǎn)中，β-gal發(fā)揮著極其重要的作用，其形成GOS的具體作用機(jī)制見圖1。首先1 分子乳糖和β-gal的活性位點(diǎn)結(jié)合，釋放葡萄糖殘基，剩下的β-gal-半乳糖基復(fù)合物進(jìn)行下一步反應(yīng)。接著，該復(fù)合物轉(zhuǎn)移到含有羥基的糖類或水分子受體上，當(dāng)溶液中乳糖濃度較低時(shí)，將促進(jìn)水分子作為受體，產(chǎn)生半乳糖；而當(dāng)溶液中乳糖濃度較高時(shí)，則乳糖等作為受體連接該復(fù)合物，最終產(chǎn)生GOS[5]。當(dāng)乳糖作為受體時(shí)，通過轉(zhuǎn)糖基作用可產(chǎn)生聚合度為3的GOS（β-D-Galp-(1→x)-β-D-Galp-(1→4)-D-Glcp），該GOS可再次作為受體底物，重復(fù)經(jīng)歷轉(zhuǎn)糖基過程。因此，轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)可產(chǎn)生具有不同結(jié)構(gòu)的GOS混合物[3]。

圖1 β-gal合成GOS的反應(yīng)[5]Fig. 1 Reaction route for the synthesis of GOS by β-gal[5]

2 具有轉(zhuǎn)糖基活力Lβ-gal和Bβ-gal的來源和酶學(xué)性質(zhì)

2.1 具有轉(zhuǎn)糖基活力Lβ-gal和Bβ-gal的來源

部分雙歧桿菌和LAB菌株能夠產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)糖基活力的β-gal，這兩類菌是篩選轉(zhuǎn)糖基活力β-gal的較好來源[9]。表1總結(jié)了目前文獻(xiàn)報(bào)道的具有轉(zhuǎn)糖基活力Lβ-gal和Bβ-gal的來源。其中，能夠產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)糖基活力β-gal的雙歧桿菌包括長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp. longum）、嬰兒長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp. infantis）、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）、角形雙歧桿菌（Bifidobacterium angulatum）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）和假長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudolongum）等。Lβ-gal的來源包括嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）等。

β-gal主要以全細(xì)胞、經(jīng)過化學(xué)處理或物理處理的細(xì)胞、破碎細(xì)胞后獲得的粗酶、粗酶經(jīng)過進(jìn)一步純化獲得的純化酶、固定化處理的酶，以及通過大腸桿菌（Escherichiacoli）、巴氏畢赤酵母（Pichia pastoris）和L. plantarum等表達(dá)宿主菌獲得的重組酶等不同形式存在。不同來源和不同形式的β-gal的酶學(xué)性質(zhì)存在差異，從而對(duì)GOS的合成過程產(chǎn)生影響。

表1 Lβ-gal和Bβ-gal的來源Table 1 Microbial sources of Lβ-gal and Bβ-gal

2.2 具有轉(zhuǎn)糖基作用的Lβ-gal和Bβ-gal的酶學(xué)性質(zhì)

基于CAZy（carbohydrate-active enzymes）數(shù)據(jù)庫(kù)，β-gal屬于糖苷水解酶家族（glycoside hydrolase families，GH）1、2、35、42和59（GH1、GH2、GH35、GH42和GH59）[35]。雙歧桿菌和乳酸菌中，僅在GH2和GH42家族中發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)糖基活力的β-gal（表2）。GH2家族中，大部分乳酸菌產(chǎn)生LacLM類型的β-gal，即由lacL和lacM兩個(gè)基因編碼形成的異源二聚體，包括L. pentosusKUB-ST10-1、L. acidophilusR22、L. plantarumWCFS1、L. sakeiLb790、L. reuteriL103等菌株[25]。而由單一lacZ基因編碼的LacZ類型β-gal在乳酸菌中不常見，僅有少數(shù)乳酸菌屬于這一類型，例如菌株L. bulgaricusDSM20081[29]。LacZ類型的β-gal在雙歧桿菌中更為常見，例如B. bifidumNCIMB 41171、B. infantisHL96、B. breveDSM 20213和B. longumCCRC 15708等雙歧桿菌菌株產(chǎn)生的β-gal均為L(zhǎng)acZ類型[19,29-30]。此外，具有轉(zhuǎn)糖基活力的Lβ-gal和Bβ-gal以GH2家族居多，只有少部分菌株屬于GH42家族，例如分別來自B. bifidumNCIMB 41171的β-半乳糖苷酶BbgII[36]和B. infantisHL96的β-半乳糖苷酶β-GalIII[37]。這是由于GH2家族的β-gal可能更傾向于催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，因此該家族β-gal轉(zhuǎn)糖基活力的研究一般得到更多關(guān)注[19]。

β-gal催化合成GOS是一個(gè)動(dòng)力學(xué)控制的反應(yīng)，該過程轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)和水解反應(yīng)同時(shí)發(fā)生[6]。但關(guān)于GOS合成反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km以及催化常數(shù)kcat的報(bào)道較少，這可能是由于GOS的形成速率很難準(zhǔn)確計(jì)算。當(dāng)Km用來計(jì)算轉(zhuǎn)糖基作用時(shí)，通常需要的數(shù)量級(jí)遠(yuǎn)高于乳糖水解的數(shù)量級(jí)，例如B. bifidum β-gal的轉(zhuǎn)糖基作用和乳糖水解的乳糖濃度分別為800 mmol/L和13 mmol/L，轉(zhuǎn)糖基作用需要提供更高的乳糖濃度才能獲得最大轉(zhuǎn)糖基速率[38]。因此，相比于轉(zhuǎn)糖基作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，關(guān)于乳糖水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)報(bào)道更多，表2總結(jié)了具有轉(zhuǎn)糖基活力的Lβ-gal和Bβ-gal的乳糖水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及β-gal參與乳糖水解反應(yīng)的最適pH值和溫度。

表2 Lβ-gal和Bβ-gal的酶學(xué)性質(zhì)Table 2 Enzymatic properties of Lβ-gal and Bβ-gal

3 Lβ-gal和Bβ-gal合成GOS的應(yīng)用

3.1 產(chǎn)生的GOS特點(diǎn)

β-gal的來源可能是影響GOS合成最重要的因素，決定了GOS的產(chǎn)量、產(chǎn)物的組成以及β-糖苷鍵的類型[11]。

3.1.1 GOS產(chǎn)量

在文獻(xiàn)中關(guān)于GOS的產(chǎn)量有多種定義，較常用的定義是GOS質(zhì)量濃度（g/L）和初始乳糖質(zhì)量濃度（g/L）的比值[15]，在本文中即采用該定義表達(dá)GOS產(chǎn)量。表3列舉了不同來源的Lβ-gal和Bβ-gal，以乳糖為底物合成GOS的反應(yīng)條件和最大產(chǎn)量。由表3可知，在不同的過程參數(shù)下，源自不同菌株的Lβ-gal和Bβ-gal轉(zhuǎn)糖基作用產(chǎn)生GOS的量在10%～70%之間不等。一般而言，GOS產(chǎn)量超過50%的β-gal較不常見，合成過程經(jīng)過優(yōu)化后，獲得的產(chǎn)量約在30%～40%之間[24]。表3中總結(jié)了目前報(bào)道的幾個(gè)GOS產(chǎn)量超過50%的Bβ-gal和Lβ-gal，例如，源自B. infantisHL96菌株的β-galI，合成的GOS產(chǎn)量達(dá)到63%[39]。B. bifidumNCIMB41171β-gal無論是存在于完整的細(xì)胞中，還是以重組酶BbgIV形式存在，其GOS產(chǎn)量均超過50%[9]。在乳酸菌中，S. thermophilusDSM20259[24]和L. bulgaricusDSM20081[29]菌株產(chǎn)生的β-gal，合成的GOS產(chǎn)量達(dá)到50%左右，是乳酸菌中GOS產(chǎn)量較高的菌株。但也存在GOS產(chǎn)量較低的β-gal，例如L. pentosusBFP32β-gal合成的GOS產(chǎn)量較低，當(dāng)以粗酶液作為催化劑，GOS產(chǎn)量?jī)H為13.9%[42]。Lβ-gal和Bβ-gal轉(zhuǎn)糖基活性存在菌株特異性，其中部分β-gal合成GOS的產(chǎn)量甚至超過60%，高于Aspergillus β-gal和Kluyveromycesβ-gal等常見來源[43]，因此可以深入探究這兩類來源的β-gal的特點(diǎn)，并應(yīng)用于GOS的工業(yè)生產(chǎn)。

表3 Lβ-gal和Bβ-gal不同反應(yīng)條件下的最大GOS產(chǎn)量Table 3 Maximum GOS yield produced by Lβ-gal and Bβ-gal under different reaction conditions

3.1.2 GOS組成及鍵接方式

Lβ-gal和Bβ-gal以乳糖為底物合成的GOS結(jié)構(gòu)為Galn-Lac；此外，也存在Gal-Gal的二糖結(jié)構(gòu)（表4）。產(chǎn)物GOS的聚合度普遍在2～5之間。例如，L. acidophilusR22β-gal合成的GOS中非乳糖二糖、三糖和四糖分別占總糖質(zhì)量的15.5%、19%和4%[32]。L. plantarumWCFS1β-gal的GOS產(chǎn)物中非乳糖二糖、三糖和四糖的占比分別為19%、21%和1.3%[40]。B. bifidumNCIMB 41171β-gal合成的GOS混合物，除了含有二糖（25%）、三糖（35%）、四糖（25%），還有15%的戊糖[21]。

商業(yè)GOS例如Elix’or的糖苷鍵類型主要為β-1,4糖苷鍵，和Lβ-gal合成的GOS存在較大的區(qū)別[40]。表4總結(jié)了不同來源Lβ-gal和Bβ-gal合成的GOS產(chǎn)物的組成和鍵接方式。Lβ-gal傾向于合成β-1,6和β-1,3糖苷鍵連接的GOS。其中這幾株LAB菌株，包括L.bulgaricusDSM20081[29]、L.reuteriL103[33]、L.plantarumWCFS1[40]和L.sakeiLB790[31]產(chǎn)生的Lβ-gal尤其傾向于合成β-1,6糖苷鍵連接的GOS；此外，在雙歧桿菌中也存在類似現(xiàn)象，將B. breveDSM 20213菌株中的lacZ基因在E. coli中表達(dá)，獲得兩種純化后的重組酶β-gal I和β-gal II，兩種酶通過轉(zhuǎn)糖基作用產(chǎn)生的主要GOS產(chǎn)物為二糖β-D-Galp-(1→6)-D-Glc和三糖β-D-Galp-(1→3)-D-Lac，都是通過β-1,6和β-1,3糖苷鍵連接的，兩種糖的總量分別超過GOS總量的75%和65%，而通過其他糖苷鍵連接的GOS產(chǎn)物則較少，僅產(chǎn)生極少量β-1,4糖苷鍵連接的三糖β-D-Galp-(1→4)-D-Lac[19]。但Bβ-gal產(chǎn)物中也存在主要通過β-1,4糖苷鍵連接的GOS產(chǎn)物，例如B. longumRD47菌株β-gal合成的三糖和四糖中，均存在β-1,4糖苷鍵[15]。相比于Lβ-gal，Bβ-gal合成的GOS糖苷鍵類型更具多樣化。

表4 Lβ-gal和Bβ-gal產(chǎn)生的GOS結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Table 4 Structural characteristics of GOS produced by Lβ-gal and Bβ-gal

3.2 影響GOS合成反應(yīng)的因素

β-gal的來源是影響GOS合成最重要的變量，決定了GOS的產(chǎn)量、產(chǎn)物的組成以及β-糖苷鍵的類型。除此之外，酶的形式、反應(yīng)條件等也會(huì)影響GOS的合成[46-47]。本文重點(diǎn)從反應(yīng)時(shí)間、乳糖濃度、反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性酶的應(yīng)用、固定化酶這5個(gè)方面，分析總結(jié)影響GOS合成反應(yīng)的因素。

3.2.1 反應(yīng)時(shí)間

β-gal以乳糖為底物合成GOS的反應(yīng)過程中，GOS的合成和降解反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，GOS產(chǎn)量和組成不斷發(fā)生變化，因此需要了解反應(yīng)時(shí)間歷程（乳糖轉(zhuǎn)化）以獲得最大的GOS產(chǎn)量[18]。L. bulgaricusDSM20081β-gal在合成GOS過程中，反應(yīng)開始時(shí)主要形成三糖，包括β-D-Galp-(1→3)-D-Lac和β-D-Galp-(1→6)-D-Lac。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，葡萄糖和半乳糖的量穩(wěn)定增加，這部分單糖成為轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的重要受體，部分非乳糖二糖開始形成，例如β-D-Galp-(1→6)-D-Glc和β-D-Galp-(1→3)-D-Glc是該階段兩種主要產(chǎn)物。反應(yīng)過程中GOS產(chǎn)量也隨著時(shí)間延長(zhǎng)不斷發(fā)生變化，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為12 h時(shí)，GOS的產(chǎn)量最高，接近50%，但在此之后，由于β-gal也能夠水解GOS，GOS濃度出現(xiàn)下降，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，GOS產(chǎn)量約降低了10%[29]。B. breve DSM20213 β-gal I和β-gal II兩種酶在合成GOS時(shí)，分別在6 h和22 h之后獲得最大GOS產(chǎn)量，但之后GOS濃度也出現(xiàn)了下降，尤其是β-gal I更為顯著[19]。因此，終止反應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)相當(dāng)嚴(yán)格，要盡可能接近最大GOS產(chǎn)量的時(shí)間點(diǎn)，以降低GOS的損失。

3.2.2 乳糖濃度

一般情況下，增加初始乳糖濃度有利于GOS的合成。初始乳糖濃度對(duì)GOS合成過程的影響主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面增加了半乳糖基受體數(shù)量，提高了GOS的合成速率；另一方面降低了水分活度，從而降低了GOS的降解速率以及乳糖水解速率[38]。但當(dāng)初始乳糖濃度過高時(shí)，GOS的產(chǎn)量出現(xiàn)下降。例如，利用L. plantarum 79810菌株的β-gal合成GOS時(shí)，當(dāng)初始乳糖質(zhì)量濃度從200 g/L升高到400 g/L時(shí)，反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)逐漸占據(jù)主體，但隨著乳糖質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，GOS產(chǎn)量減少[27]。B. longum BCRC 15708菌株的β-gal催化反應(yīng)中，當(dāng)乳糖初始質(zhì)量濃度從50 g/L增加到400 g/L時(shí)，GOS產(chǎn)量不斷增加，質(zhì)量濃度為400 g/L時(shí)，產(chǎn)量最高，但隨著乳糖質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加，GOS產(chǎn)量出現(xiàn)減少，與L. plantarum 79810菌株的反應(yīng)趨勢(shì)一致[44]。而出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因，可能是由于高濃度乳糖底物，伴隨著高含量半乳糖和葡萄糖轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物的產(chǎn)生，而這兩種產(chǎn)物是β-gal的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，從而降低了GOS的合成[27]。因此，在一定范圍內(nèi)提高初始乳糖濃度有利于提高GOS產(chǎn)量。

3.2.3 反應(yīng)溫度

提高溫度有利于促進(jìn)GOS的合成，主要原因是由于溫度的升高增加了反應(yīng)速率和底物的溶解度。例如，Geiger等[24]將S. thermophilus DSM20259菌株中編碼β-gal的lacZ基因，在L. plantarum中表達(dá)獲得重組β-gal粗酶提取液后，分別在37 ℃和50 ℃條件下合成GOS，在50 ℃條件下反應(yīng)5 h，GOS產(chǎn)量接近總糖的50%；當(dāng)反應(yīng)溫度降低到37 ℃時(shí)，需要反應(yīng)8.5 h才能達(dá)到50%的產(chǎn)量。但不同來源β-gal的適宜反應(yīng)溫度范圍具有菌株特異性，Zhang Hongzhi等[27]以超聲破碎處理后的L. plantarum 79810菌株作為β-gal源合成GOS，當(dāng)反應(yīng)溫度分別為30、37、45 ℃和50 ℃時(shí)，GOS的最高產(chǎn)量分別為26.5%、36.8%、43.5%和15.6%；當(dāng)溫度從30 ℃升高到45 ℃時(shí)，乳糖轉(zhuǎn)化率從46.85%升高到78.25%，GOS產(chǎn)量逐漸增加；但隨著溫度從45 ℃升高到50 ℃，GOS產(chǎn)量出現(xiàn)顯著下降。此外，溫度可能對(duì)GOS產(chǎn)量無顯著影響。Nguyen等[29]利用L. bulgaricus的β-gal合成GOS時(shí)，反應(yīng)溫度對(duì)GOS產(chǎn)物的最大產(chǎn)量以及組成影響很小，溫度為30、40、50 ℃時(shí)，產(chǎn)量分別為49.5%、48.7%、48.2%；GOS混合物的主要組成成分未發(fā)生改變，且產(chǎn)量只發(fā)生微量變化。因此，針對(duì)不同來源的β-gal，需探究適宜的反應(yīng)溫度以提高GOS產(chǎn)量。

3.2.4 熱穩(wěn)定性酶的應(yīng)用

升高溫度通常能夠促進(jìn)GOS產(chǎn)生，但β-gal的熱穩(wěn)定性可能限制其在工業(yè)化規(guī)模上的應(yīng)用；因此許多學(xué)者針對(duì)熱穩(wěn)定性酶的來源和特性展開重點(diǎn)研究[48-49]。熱穩(wěn)定性β-gal在應(yīng)用時(shí)，提高反應(yīng)溫度、增加初始反應(yīng)乳糖濃度，不僅可提高GOS產(chǎn)量，同時(shí)能夠限制其他微生物的污染[38]。目前普遍認(rèn)為，來自嗜熱微生物的β-gal在較高溫度下轉(zhuǎn)糖基活力較高，是適于合成GOS的生物催化劑；而來自乳酸菌和雙歧桿菌的β-gal合成GOS的反應(yīng)溫度一般不超過55 ℃。然而，Osman等[9]首次在雙歧桿菌B. bifidum NCIMB 41171菌株中分離純化出一種β-半乳糖苷酶BbgIV，它能夠在65 ℃條件下有效合成GOS，最大GOS產(chǎn)量達(dá)到54.8%，高于一般水平。GOS生產(chǎn)率在65 ℃條件下達(dá)到35.1 g/（L·h），遠(yuǎn)高于生產(chǎn)率分別為4.8、12.7、24.3 g/（L·h）和18.2 g/（L·h）的菌株布勒擲孢酵母（Bullera singularis）、B. infantis HL96、米曲霉（Aspergillus oryzae）和海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）；該發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了Bβ-gal在65 ℃高溫下合成GOS的可能，說明Bβ-gal在合成GOS方面具有很大的潛力。

3.2.5 酶的固定化處理

除了篩選熱穩(wěn)定性強(qiáng)的Lβ-gal和Bβ-gal以外，酶的固定化處理也可提高β-gal的穩(wěn)定性。固定化處理是將酶限制在一定區(qū)域內(nèi)，保留催化活力，從而增加酶的穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性，其核心的技術(shù)問題在于載體材料的制備與選擇[50]。關(guān)于Bβ-gal的固定化研究較少，Osman等[47]首次將B. bifidum NCIMB41171菌株產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶BbgIV固定化處理后合成GOS，相比于游離的BbgIV，DEAE纖維素、Q-瓊脂糖凝膠和氨基乙基瓊脂糖固定化BbgIV在45 ℃和55 ℃下穩(wěn)定性提高；其中，Q-瓊脂糖凝膠固定化BbgIV在45 ℃和55 ℃下反應(yīng)僅2 h即獲得最大產(chǎn)量的GOS（49%～53%），而游離BbgIV合成最大產(chǎn)量GOS（49%～53%）則分別需要20 h和16 h；此外，Q-瓊脂糖凝膠固定化BbgIV在55 ℃高溫下重復(fù)使用6 次后，活力仍保留了67.5%。因此，固定化處理也將會(huì)對(duì)GOS合成成本產(chǎn)生重要的影響。

4 結(jié) 語

雙歧桿菌和乳酸菌被認(rèn)為是GRAS微生物，是β-gal較好的來源，在生產(chǎn)GOS方面具有非常重要的價(jià)值。目前，Clasado公司利用B. bifidum NCIMB41171菌株產(chǎn)生的GOS已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，GOS質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到48%[51]。此外，S. thermophilus菌株產(chǎn)生的β-gal在將乳清中的乳糖轉(zhuǎn)化為GOS方面也有較好的應(yīng)用[24]。

β-gal的來源和反應(yīng)條件等影響GOS的類型、產(chǎn)量以及特殊糖苷鍵的形成。未來的研究方向，一方面需要進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)糖基活力高的Lβ-gal和Bβ-gal，充分利用高乳糖含量的乳清等乳制品工業(yè)廢棄物，優(yōu)化反應(yīng)過程，提高GOS產(chǎn)量和純度，從而減少乳清等對(duì)環(huán)境的污染，增加經(jīng)濟(jì)效益[52]；另一方面，在嬰兒配方粉中通常添加GOS模擬母乳寡糖的結(jié)構(gòu)和益生作用，但GOS結(jié)構(gòu)的多樣性顯著低于母乳寡糖[3,53]。因此需要深入探究Lβ-gal和Bβ-gal酶學(xué)性質(zhì)和產(chǎn)生的GOS特點(diǎn)，通過結(jié)構(gòu)定點(diǎn)飽和誘變等生物工程技術(shù)，豐富GOS結(jié)構(gòu)的多樣性，從而擴(kuò)大工業(yè)化應(yīng)用。