馬秀麗，黃文勝，張九凱，韓建勛，葛毅強*，陳 穎,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3.中國農村技術開發(fā)中心，北京 100045）

芝麻（Sesamum indicum）又名脂麻、胡麻，在熱帶和亞熱帶廣泛種植，據海關數據統(tǒng)計，2016年全球芝麻實際生產量約為450.90萬 t。我國是芝麻生產、消費大國，2015年出口3.15萬 t，進口80.59萬 t，2016年產量63.00萬 t[1]。芝麻油和芝麻醬是深受百姓喜愛的調味品，芝麻籽因其受熱能產生濃香，被用作調味料廣泛添加于糕點、菜肴和飲品中。同時，芝麻也是常見的食物過敏原之一，芝麻過敏患者在接觸芝麻及制品后會出現(xiàn)包括皮膚和黏膜反應、呼吸反應、胃腸道反應在內的全身性反應，甚至可能休克或死亡[2-3]。

流行病學調查發(fā)現(xiàn)，美國約有50萬消費者對芝麻及其制品過敏[4]。各國兒童對芝麻及其制品過敏的比例為0.1%～0.8%，其中美國和加拿大0.1%、澳大利亞0.8%、以色列0.2%[5-9]。在以色列，芝麻是僅次于牛奶和雞蛋的第三大常見食物過敏原[10]。歐洲（意大利、法國、英國、丹麥、瑞典、瑞士等）及亞洲（日本）各國都有芝麻過敏的相關報道[11-14]。近年來，隨著芝麻過敏發(fā)病率的升高，芝麻過敏已引起全球很多國家重視[15-17]。

由于芝麻及其制品在食品中使用廣泛，芝麻過敏患者生活中接觸芝麻過敏原的機會也大幅增加。各國開展了對芝麻過敏原閾值的相關研究，發(fā)現(xiàn)芝麻過敏原的引發(fā)劑量（eliciting dose，ED）05在芝麻蛋白的1.2～4.0 mg之間，ED10在4.2～6.2 mg之間[18-22]。過敏原的正確標識是預防過敏患者誤食相關食品的唯一有效途徑[23-24]。歐盟、加拿大、澳大利亞和新西蘭等國要求含有芝麻成分的食品必須進行標識[25-29]，2014年日本也建議生產商對含芝麻制品進行過敏原標識[18]。

食品在各生產環(huán)節(jié)（加工、儲存、運輸、銷售）都有可能被芝麻過敏原污染（無意污染）[30]。明確芝麻過敏原蛋白氨基酸序列、晶體結構及其免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E結合表位等生物信息，建立芝麻過敏原成分定性、定量檢測方法，對于預防芝麻過敏、探討食品加工過程對蛋白過敏原性的影響評估、開展致敏性消減研究等都具有重要意義。

本文旨在對各國對芝麻過敏原的管理規(guī)定、芝麻過敏原蛋白的結構特征、加工過程對其結構及致敏性影響、檢測方法等方面的研究進展進行綜述，總結芝麻過敏原的研究現(xiàn)狀，并對未來研究趨勢進行展望。

1 芝麻主要過敏原蛋白結構和功能研究進展

截至2017年，經國際免疫學會聯(lián)合會（International Union of Immunological Societies，IUIS）確認的芝麻主要過敏原包括2 種2S白蛋白（Ses i 1（9～14 kDa））和Ses i 2（7 kDa）、1 種7S類豌豆球蛋白（Ses i 3（45 kDa））、2 種油質蛋白（Ses i 4（17 kDa）和Ses i 5（15 kDa））、2 種11S球蛋白（Ses i 6（52.2 kDa）和Ses i 7（56.6 kDa））[31-35]。其中2S白蛋白和11S球蛋白是主要的過敏原蛋白。以上幾種芝麻過敏原蛋白的生物化學特征、生物學功能以及在數據庫中的信息總結如表1所示。

表1 芝麻主要過敏原蛋白Table 1 Major sesame allergens

1.1 芝麻主要過敏原Ses i 1和Ses i 2

Ses i 1和Ses i 2屬于醇溶蛋白超家族（AF050）中的2S白蛋白家族，該類蛋白占芝麻總蛋白的25%左右[36]。醇溶蛋白超家族主要是依據其在醇-水混合物中的溶解性而定義[37]，該家族成員通常分子質量低，在低濃度鹽溶液中可溶于水，富含精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸殘基[38]，含約100 個氨基酸殘基，其中含有6～8 個半胱氨酸殘基用于分別形成3～4 個二硫鍵，以維系蛋白質在合成后修飾切割形成的大小為兩個亞基的正常折疊結構。通常認為2S白蛋白可直接通過胃腸道致敏。其高度穩(wěn)定的蛋白結構表明，這些蛋白質可以穿過腸道黏膜屏障，使黏膜免疫系統(tǒng)處于致敏狀態(tài)或引起過敏反應[39-40]。

Ses i 1和Ses i 2是芝麻中主要的過敏原蛋白[32]，根據Uniprot蛋白數據庫分析，由cDNA推導的Ses i 1含有153 個氨基酸，其序列如圖1A所示，氨基酸1～21為信號肽。天然過敏原蛋白等電點為7.3，含有大小兩個亞基，二者等電點分別為6.5和6.0，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得的分子質量9 kDa[32]，有較好的水溶性，且富含硫元素。Uniprot蛋白數據庫中Ses i 2被命名為2S種子貯藏蛋白，又名2S貯藏白蛋白、β-球蛋白。其前體蛋白序列如圖1B所示，含有148 個氨基酸，氨基酸1～19為信號肽，小亞基位于氨基酸39～68，大亞基位于氨基酸77～146。大亞基的分子質量為7 kDa。天然的Ses i 2有15 個蛋氨酸（M）和10 個半胱氨酸（C），其中8 個半胱氨酸在大、小亞基間形成兩個鏈間二硫鍵（42?97、54?86），在大亞基內形成兩個鏈內二硫鍵（87?133、99?141），用以維持其正常的三維結構[39]，其蛋白結構模型如圖2所示。Ses i 1與核桃（Juglans regia）中的2S白蛋白Jug r 1有38.56%的同源性，但序列比對結果顯示Jug r 1中重要的IgE結合抗原表位與Ses i 1中相應位置的序列同源性有限[41]（圖3A），與榛子（Corylus avellana）過敏原Cor a 14有44%的同源性。Ses i 2與Jug r 1、Ses i 1分別有35.14%、38.5%的同源性（圖3B），與巴西堅果（Bertholletia excelsa）過敏原Ber e 1、碧根果（Carya illinoinensis）過敏原Car i 1的同源性分別為39.9%、37.8%。也有研究認為，該前體蛋白形成14 kDa的β-球蛋白是主要的過敏原蛋白[31]。通過使用重疊肽段文庫篩選的方法來鑒定其與人血清抗體的結合位點，其中SRQCQMRHCM、QCQMRHCMQW、NQGQFEHFREC 3 條肽段最可能含有致敏的抗原表位[40]（圖4中綠色標注部分）。而這些抗原表位與巴西堅果Ber e 1、蓖麻（Ricinus communis）過敏原Ric c 1的同源性分別為35%、45%[40]。

圖1 芝麻過敏原氨基酸序列[32-33]Fig. 1 Amino acids sequences of sesame allergens[32-33]

圖2 芝麻過敏原Ses i 1和Ses i 2蛋白模型[44]Fig. 2 Protein models of sesame allergen Ses i 1 and Ses i 2[44]

圖3 芝麻過敏原Ses i 1、Ses i 2與核桃過敏原Jug r 1序列比對結果[41]Fig. 3 Sequence alignment s of sesame allergen Ses i 1, Ses i 2 and walnut allergen Jug r 1[41]

圖4 芝麻過敏原蛋白（Ses i 2）抗原表位空間構象[40]Fig. 4 Spatial conformation of epitope in sesame allergen (Ses i 2)[40]

此外，Moreno等[42]發(fā)現(xiàn)Ses i 1可耐受溫度為90 ℃，在酸性和中性條件中均穩(wěn)定，并在胃腸道消化實驗中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。Orru?o等[43]用蛋白酶消化純化2S白蛋白，發(fā)現(xiàn)2S白蛋白（Ses i 1、Ses i 2）在天然狀態(tài)下對胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的消化均有很強的抗性，并且二者的氨基酸序列中都不存在糖基化修飾位點[33]。

1.2 芝麻主要過敏原Ses i 3

Beyer等[33]發(fā)現(xiàn)Ses i 3可以被75%的芝麻過敏患者血清所識別，是芝麻中另一種主要過敏原。Ses i 3是7S類豌豆球蛋白，屬于Cupin超家族（AF045），該超家族的成員在其三維空間結構中具有β-折疊桶的蛋白質超二級結構，β-折疊桶是由很多的β-折疊片層以螺旋的形式纏繞在一起，筒中心由疏水氨基酸殘基組成，并通過氫鍵維系形成的一種封閉的結構[45]。具有兩個Cupin結構域的蛋白最初是在高等植物種子儲藏蛋白中發(fā)現(xiàn)的，分為7S球蛋白三聚體（豌豆球蛋白）和11S球蛋白六聚體（豆球蛋白），這兩種蛋白也是芝麻中主要的過敏原。Ses i 3在芝麻7S類豌豆球蛋白中含量最多[33]，分子質量為45 kDa，缺乏二硫鍵。cDNA推導的Ses i 3前體由585 個氨基酸組成[44]，氨基酸1～23是信號肽，氨基酸202～354和氨基酸395～560是其兩個結構域，其蛋白三維結構模型如圖5所示，與β伴大豆球蛋白具有相似的Cupin結構，都是由兩個串聯(lián)排列的Cupin模體結構組成。Orru?o等[46]采用選擇性沉淀法和陰離子交換色譜法從芝麻籽中分離純化出7S類豌豆球蛋白，發(fā)現(xiàn)所分離的4 條蛋白帶中均含有與前體蛋白氨基酸序列（E181）REEEQEEQG、（G389）ESKGTINIY相同的肽段，為同源序列。Ses i 3與花生中的Ara h 1（7S球蛋白）整體上有36%的同源性，在Ara h 1大部分的已知抗原表位相應區(qū)域二者同源性不高[47]，但在Ara h 1中已知的某個IgE結合抗原表位（TPGQFEDFFP）上二者相應的區(qū)域有高達80%的同源性，且兩者的差異氨基酸也在IgE關鍵識別位點之外[33]，如圖6所示。因此，在花生過敏患者中，Ses i 3和Ara h 1的IgE抗體之間的會有交叉反應，這點與花生和大豆之間的交叉反應類似[48]。此外Ses i 3前體蛋白和開心果（Pistacia vera）過敏原Pis v 3、榛子（Corylus avellana）過敏原Cor a 11之間分別有47%、42%的同源性。Ses i 3在自然狀態(tài)下容易被胃蛋白酶酶解，對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的抵抗性較強[43]。

圖5 芝麻過敏原Ses i 3蛋白模型[44]Fig. 5 Protein model of sesame allergen Ses i 3[44]

圖6 芝麻過敏原Ses i 3與花生過敏原Ara h 1序列比對結果[47]Fig. 6 Sequence alignment of sesame allergen Ses i 3 and peanut allergen Ara h 1[47]

1.3 芝麻主要過敏原Ses i 4和Ses i 5

Leduc等[34]發(fā)現(xiàn)32 例芝麻過敏患者血清中全部含有油質蛋白（17 kDa和15 kDa）特異性IgE抗體，說明二者也是芝麻的主要過敏原。IUIS將其命名為Ses i 4和Ses i 5，屬于Oleosin家族（AF090），該家族中的過敏原種類較少，目前已知的有花生中的Ara h 10、Ara h 11，榛子中的Cor a 12、Cor a 13等[49-51]。

Ses i 4由166 個氨基酸組成，是一種α-螺旋跨膜蛋白，參與跨膜肽段為40～69、81～114，如圖7A所示。它與榛子中的油質蛋白過敏原Cor a 12有54%的同源性，與花生中的油質蛋白過敏原Ara h 10有46%的同源性。Ses i 5由198 個氨基酸組成，參與跨膜肽段為38～64、70～99，如圖7B所示。它與Cor a 13的同源性高達75%，與Ara h 11的同源性達66%。何凡等[52]克隆了芝麻油質蛋白Oleosins的基因并在原核細胞中表達，重組蛋白分子質量約為15.5 kDa，等電點為5.18。

圖7 芝麻過敏原Ses i 4和Ses i 5氨基酸序列[34]Fig. 7 Amino acid sequences of sesame allergens Ses i 4 and Ses i 5[34]

1.4 芝麻主要過敏原Ses i 6和Ses i 7

Ses i 6和Ses i 7屬于Cupin超家族（AF045）中的Legumin家族（11S球蛋白），成熟的11S球蛋白通常以六聚體形式存在，分子質量約為360 kDa。一般情況下，11S球蛋白單體經過翻譯后修飾由酸性亞基（30～40 kDa）與堿性亞基（20 kDa）經過分子間二硫鍵連接而成[53]。水不溶性11S球蛋白約占芝麻總蛋白的60%～70%，是芝麻蛋白的主要組成部分。據Uniprot蛋白數據庫分析，Ses i 6是由459 個氨基酸組成的，氨基酸序列如圖8所示，其中氨基酸1～21是信號肽，氨基酸22～277 為酸性肽鏈，氨基酸278～459是堿性肽鏈，兩肽鏈之間通過二硫鍵連接（110?284），分子質量為52.2 kDa[54]。Ses i 7也屬于11S球蛋白，分子質量為56.6 kDa[55]，結構與Ses i 6相似，由酸性和堿性兩條肽鏈組成，兩者有38%的同源性。Ses i 6、Ses i 7與花生中的Ara h 3（11S球蛋白）整體上有39%的同源性，在Ara h 3中已知的IgE結合抗原表位上二者相應的區(qū)域有較高的同源性，且在IgE關鍵識別位點上也有很多相同（圖9）。并且二者已被成功克隆和重組表達，Magni等[56]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，Ses i 6可以激活嗜堿性細胞，并與核桃過敏原存在交叉反應，與天然蛋白質相比，其重組蛋白由于沒有經過加工產生兩條肽鏈，免疫反應活性比天然11S球蛋白要低得多。與Ses i 3相似，二者在天然狀態(tài)下易被胃蛋白酶消化，但對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的抵抗性較強[43]。與其他Cupin超家族成員相比，成熟后正常行使功能的11S球蛋白很少發(fā)生糖基化[53]，而蛋白是否發(fā)生糖基化也被認為與過敏原的致敏性有關。

Stutius等[57]考察了美國兒童對堅果、花生過敏與對椰子、芝麻過敏之間的關系，發(fā)現(xiàn)對花生或堅果過敏的兒童更易對芝麻過敏，說明芝麻和花生、堅果之間存在交叉過敏反應。Achouri等[58]考察了pH值、高壓（100～500 MPa）和熱處理（煮沸、微波加熱、烘焙）等不同的提取條件對芝麻總蛋白濃度、二級結構及酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）反應的影響，發(fā)現(xiàn)使用水和較低鹽濃度（0.2 mol/L NaCl）制備的蛋白具有更高的免疫活性，高鹽濃度促進鹽析和聚集，可能會阻止表位與抗體反應，高壓處理顯著降低了芝麻蛋白的抗原性，沸水和烘烤等熱處理方法增加了ELISA反應活性，而微波處理則相反。經傅里葉變換紅外光譜分析，可能是蛋白質結構變化導致抗原表位破壞、掩蔽或暴露，從而減少或增加其免疫原反應，但未對芝麻中各過敏蛋白進行單獨研究。

圖9 芝麻過敏原Ses i 6、Ses i 7與花生過敏原Ara h 3序列比對結果[55]Fig. 9 Sequence alignment of sesame allergens Ses i 6, Ses i 7 and peanut allergen Ara h 3[55]

綜上，目前芝麻中已知的過敏原有Ses i 1～Ses i 7共7 種，主要過敏原是2S白蛋白和7S、11S球蛋白，其致敏活性由其抗原表位決定。熱處理、超高壓等食品加工過程可改變或破壞食物過敏原結構及其抗原表位，從而改變其致敏性。對芝麻各過敏原分子結構、理化性質、抗原表位以及加工過程對過敏原影響的研究是開展食物脫敏技術的基礎。然而，芝麻中過敏原組分較多，不同過敏原的空間構象以及抗原表位的數量構型皆不相同，在消減致敏性的同時又需兼顧食品品質，這給研究過敏原消減技術帶來了難題與挑戰(zhàn)。并且，目前沒有任何脫敏技術能夠完全消除芝麻過敏原的致敏性。而芝麻過敏原常具有較強的致敏性，能夠誘發(fā)嚴重的食物過敏反應，甚至會導致休克或者死亡。目前消費者對于過敏食物的預防主要來自于明確的標簽標識。因此，準確、可靠的芝麻過敏原檢測方法顯得尤為重要。

2 芝麻過敏原檢測方法研究進展

過敏原的檢測技術分為針對蛋白質和核酸兩類。其中，基于核酸的檢測技術有各種聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）；基于蛋白質的檢測技術有免疫學方法、電泳、質譜（mass spectrometry，MS）和高效液相色譜法等。

2.1 基于核酸的檢測方法

基于核酸的檢測技術主要是以DNA/RNA為標志物鑒定過敏原種類。在食品加工熱處理過程中，致敏蛋白結構容易被破壞[58]，而過敏原的DNA相更耐受高溫處理。相比于檢測過敏原蛋白成分，檢測DNA殘留顯得更加靈敏可靠[59]。目前基于核酸技術的芝麻過敏原檢測方法主要包括常規(guī)PCR技術、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、多重PCR以及其他PCR衍生技術等。

2.1.1 常規(guī)PCR技術

PCR由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增。PCR法的突出特點是其具有極高的靈敏度，這在檢測食品過敏原成分時極為重要[59]，并成為某些國家食品安全檢測機構或實驗室的官方方法。王瑋等[60]依據芝麻2S白蛋白mRNA基因設計的特異性引物序列，擴增片段為62 bp，并且在普通PCR方法的基礎上，通過2 組4重PCR擴增，建立了檢測包括芝麻在內的8 種過敏食物成分的PCR方法，檢測限為100 pg。該方法可用于食品中過敏原成分的快速檢測，并為開展新型、快速、高通量的食物過敏原可視薄膜生物傳感器檢測方法提供了技術基礎[61]。

2.1.2 qPCR技術

傳統(tǒng)PCR技術對擴增產物進行終點檢測，而qPCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，在PCR擴增過程中實時檢測和收集熒光信號積累。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數實時存在線性關系，所以成為定量的依據。qPCR技術主要包括TaqMan qPCR法和SYBR Green qPCR法。TaqMan qPCR法是利用雙熒光標記探針的熒光基團解離產生的熒光強度變化定量PCR產物。Brzezinski等[62]采用TaqMan qPCR法，根據芝麻2S白蛋白基因設計特異性引物探針，擴增長度為66 bp，對芝麻、多種堅果（扁桃仁、腰果、榛子、胡桃、巴西胡桃）、花生、南瓜籽、葵花籽、罌粟籽DNA擴增，發(fā)現(xiàn)只有芝麻可以產生特異性的擴增曲線，且與其他過敏食品DNA無交叉反應，靈敏度可達5 pg DNA，以餅干為基質的最低檢測限為50 mg/kg。在市售的咸餅干、堅果水果棒、豆沙泥中都有檢測到芝麻DNA成分。SYBR Green qPCR法是利用SYBR熒光染料特異地插入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。Pafundo等[63]利用SYBR?GreenER?技術建立了一種能同時鑒定食品中芝麻、扁桃仁、榛子、腰果、花生等的多重實時熒光定量PCR方法，對芝麻的檢測靈敏度可達0.5 pg DNA。制定的芝麻定量標準曲線R2＝0.999 8，并利用該方法在市售的餅干、面包、巧克力中檢測到了芝麻DNA成分。Sch?ringhumer等[64]利用芝麻過敏原Ses i 1的基因片段，對牛奶巧克力米餅、餅干、醬料等食品中的芝麻成分進行了鑒別，其最低定量限為50 pg基因組DNA。另外，Mustorp[65]和Waiblinger[66]等建立了qPCR方法檢測食品中的芝麻成分，分別在小麥粉/大米粉餅干和醬料中加入過敏原成分，定量范圍在10～123 mg/kg，與Brzezinski等[62]建立的方法（檢測限為50 mg/kg）相比，檢測限更低（10 mg/kg）。Sch?ringhumer等[67]建立雙重PCR方法檢測食品中的芝麻和榛子過敏原。

2.1.3 其他方法

微芯片毛細管電泳-PCR技術在利用常規(guī)PCR檢測過敏原時，對PCR擴增終點DNA片段的測定是檢測方法靈敏度的關鍵。傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳對長度差異小的DNA片段分辨準確率較低且操作繁瑣等缺點。微芯片毛細管電泳是近年來快速發(fā)展且應用前景廣泛的新技術，其顯著優(yōu)點是微量、可自動化、結果更加準確。Co?sson等[68]利用微芯片毛細管電泳-PCR技術建立了一種同時檢測芝麻、芹菜過敏原的多重PCR方法。根據芝麻2S白蛋白基因設計特異性引物探針，擴增片段長度為339 bp，利用微芯片毛細管電泳對終點擴增產物進行測定，檢測限可達1 μg/g，可達到單重PCR方法的靈敏度。相比于之前的PCR方法，該方法的靈敏度提高。

多重連接探針擴增法（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）是基于在PCR技術發(fā)展起來的新技術，能夠對待檢DNA序列進行定性和半定量分析。每個MLPA探針包括兩個熒光標記的寡核苷酸片段，二者與靶序列進行雜交，之后使用連接酶連接好兩部分探針。接著用一對通用引物擴增連接好的探針，通過毛細管電泳分離每個探針的擴增產物，在一次反應中可以檢測40～50 個核苷酸序列，該技術高效、特異[69]。López-Calleja等[70]利用MLPA同時檢測芝麻、向日葵、罌粟、亞麻籽和大豆5 種食物過敏原，通過PCR法擴增連接探針，利用毛細管電泳檢測擴增產物，并通過對50 種植物樣品進行分析驗證方法的特異性，該方法的檢測限為10 mg/kg；通過qPCR技術對方法的準確性進行驗證；通過對56 種商業(yè)產品的分析，驗證MLPA方法的適用性，也發(fā)現(xiàn)了部分商品未按規(guī)定進行過敏原標識。

近幾十年來，以核酸為標志物的物種種類鑒別檢測方法飛速進步，并獲得了廣泛應用。在檢測過敏原成分方面。PCR方法的突出優(yōu)點是具有極高的靈敏度、特異性強、能夠克服交叉反應的影響，避免對單一特異性抗體的需求。DNA比大多數蛋白的熱穩(wěn)定性高，因此，PCR方法能用于各種加工食品中過敏原成分的檢測。目前，傳統(tǒng)PCR和qPCR已經廣泛應用于國內外食品中芝麻過敏原成分的檢測。但是，PCR法檢測的是DNA而非致敏性蛋白，檢測的結果并不能真正反映食品的致敏性。并且在PCR過程中擴增效率的影響因素諸多，實際樣品和標準樣品之間、不同樣品之間的擴增效率差異均能影響Ct值，致使定量檢測結果不準確。所以qPCR的定量只是半定量，其準確度和重現(xiàn)性難以滿足行政執(zhí)法和貿易商品檢測的要求。

2.2 基于蛋白的檢測方法

蛋白質通常具有一定種內保守性和種間特異性，也可以作為物種鑒別技術的理想分析對象，基于蛋白的檢測方法主要有基于過敏原/抗體的免疫學方法和MS分析等。

2.2.1 免疫技術

免疫學技術是通過抗原和抗體的特異性結合反應和信號放大技術達到鑒定食品過敏原成分的方法。主要包括ELISA、放射過敏原吸收抑制實驗、免疫印跡和免疫擴散及各種試劑盒等，其中以ELISA方法的應用最為廣泛。

ELISA法是利用抗體抗原之間的高度特異性反應和酶的高效催化作用相結合發(fā)展建立的一種免疫分析方法，能夠直接檢測致敏蛋白，它是芝麻過敏原檢測的常用方法之一，具有特異性高、敏感性強和準確性高等優(yōu)點。目前，用于芝麻過敏原的檢測方法有雙抗夾心ELISA法和競爭ELISA法。Husain等[71]建立了芝麻蛋白間接競爭ELISA法，在脆面包、餅干等樣品中的檢測限和定量限分別為5 μg/g和30 μg/g（芝麻蛋白/食品），在新鮮的面包和面包卷中分別為11 μg/g和49 μg/g（芝麻蛋白/食品）。Redl[72]和Maruyama[73]等建立了雙抗體夾心ELISA法檢測芝麻過敏原，以芝麻蛋白免疫雞和兔制得包被抗體和二抗，在全谷物面包中的檢測限和定量限分別為0.5 μg/g和0.6 μg/g。目前針對芝麻過敏原的商業(yè)化ELISA試劑盒主要有Tepnel、R-Biopharm、ElisaSystems等公司的產品，其能夠進行定性和半定量檢測。以上ELISA方法和試劑盒主要針對芝麻總蛋白或2S球蛋白進行檢測，雖然方便快捷，但也存在低通量、高基質干擾、交叉反應等缺點[74]。目前ELISA法檢測食物中芝麻過敏原的研究實驗中所針對的過敏原有所差異，即只檢測單一過敏原，或只檢測總過敏原[75]。

2.2.2 質譜法

基于MS技術的蛋白質鑒定基本原理是將蛋白質酶解成多肽，將多肽混合物色譜分離后進行MS或串聯(lián)MS（tandem mass spectrometry，MS/MS）分析，得到的數據與蛋白質數據庫進行比對，從而鑒定蛋白質[76]。MS既不存在免疫學方法通量低和交叉干擾的弊端，也克服了PCR技術不能直接檢測致敏蛋白質的缺點[76-77]，能結合蛋白質組學方法對蛋白質和多肽進行準確鑒定和定量，并可以同時檢測多種過敏原，其正逐漸成為食品過敏原檢測的主流方法[78-80]。目標過敏原的定量檢測主要采用智能選擇或多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，MRM的顯著優(yōu)點是具有較高的靈敏度和特異性，能夠在復雜的樣品中對蛋白質進行定量[81]。

Huschek等[82]以100 mmol/L碳酸氫銨+4 mol/L尿素+5 mmol/L二硫蘇糖醇（pH 8.2）溶液提取蛋白，采用溶液內酶切的方式得到酶切肽段，利用Nexera UHPLC/HPLC及SCIEX QTRAP 5500 MS/MS 液相色譜-MS聯(lián)用（liquid chromatograph-MS，LC-MS）系統(tǒng)定性定量食品中的芝麻含量。以11S球蛋白Ses i 6的3 條肽段為芝麻過敏原的特征肽段（表2），并將同位素標記的特征肽段作為內標，在面包、小麥原料粉、餅干中進行芝麻過敏原的定量，回收率為70%～113%，定量限為10～50 mg/kg（過敏食物/食品基質）。MS檢測依賴蛋白數據庫，數據庫不全等問題容易導致特征肽段的非特異性。經本團隊的初步研究表明，表2中的芝麻過敏原Ses i 6特異肽段SPLAGYTSVIR實際在碧根果蛋白酶切肽段中也存在。因此，在靶肽段的特異性驗證時需要擴大陰性樣品范圍，降低非特異性。該方法用穩(wěn)定同位素標記的特征肽作為內標，在前處理結束后加入樣品中用以校正MS離子化的不穩(wěn)定性，而且能校正基質對酶切過程造成的干擾，使建立的方法更加準確可靠。由此可見，LC-MS檢測技術是檢測過敏原蛋白的有效新方法。

表2 芝麻過敏原蛋白11S球蛋白Ses i 6的MS定量特征肽及其離子對[82]Table 2 Parent and daughter ions for signature peptides of seasame allergen Ses i 6[82]

基于抗原抗體特異性反應的免疫學方法或非免疫性的MS分析等方法都有其優(yōu)缺點，需要針對不同樣品找到最適合的檢測方法。其中，以ELISA為主的免疫學方法操作簡單、專業(yè)要求低、使用范圍廣泛、靈敏度高、通量高，可以同時檢測大量樣品、成本低。但其難點是需要抗原穩(wěn)定、特異性要求高的單克隆抗體，否則在復雜基質中檢測時容易出現(xiàn)交叉反應，產生假陽性結果。加工過程能夠改變蛋白的結構，其中包括過敏原蛋白的抗原決定簇。這將導致該方法對加工后樣品中過敏原成分鑒定和定量檢測的準確度降低，常常需要其他方法輔助檢測。

目前，鳥槍法和MS技術相結合檢測食品中過敏原成分成為新的發(fā)展方向。該方法前處理簡單，在MS分析前無需通過雙向電泳等方法分離蛋白，只需將提取的總蛋白酶解成肽段混合物，通過MS分析目標蛋白的特征肽段，達到鑒定的目的。以MRM分析特征肽含量，即可實現(xiàn)多種過敏原成分的同時定量檢測。該方法無需合成抗體，新成分檢測時開發(fā)方法周期短；基于非免疫性的特征肽段相比于整個蛋白在檢測時受加工影響較小，方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性高。該方法的關鍵是篩選特異性強、穩(wěn)定的肽段作為特征肽段，保證檢測方法的準確、穩(wěn)定、可靠性。MS技術正在食品安全領域被逐步推廣，因此，蛋白組學結合MS技術檢測過敏原成分具有廣闊的前景。

3 結 語

芝麻種植范圍遍布世界，被稱為全能營養(yǎng)庫，是重要的油料和食品保健品常用加工原料，但其使用的廣泛性給芝麻過敏患者帶來諸多風險。目前成功被鑒定出7 種過敏原Ses i 1～Ses i 7，近年來引起各國廣泛關注。芝麻過敏反應是IgE介導的I型超敏反應，芝麻過敏反應可發(fā)生在各個年齡段，輕者可出現(xiàn)口腔黏膜過敏、皮膚蕁麻疹等，重者可出現(xiàn)咽喉水腫、急性哮喘、過敏性休克，甚至導致死亡。

截至目前，飲食上嚴格控制芝麻的攝入仍然是避免芝麻過敏反應最為有效的途徑，消費者對于過敏食物的預防主要來自于明確的標簽標識。因此，準確、可靠的芝麻過敏原檢測方法顯得尤為重要。對于芝麻過敏原，目前主要的檢測方法是PCR法和ELSIA法。PCR法靈敏度高、特異性強。ELISA法的操作簡單、靈敏度高。二者作為芝麻過敏原定性檢測方法研究較為充分，但是在食品過敏原的標簽管理中，對于過敏原含量的檢測十分重要，需要依靠可靠的定量技術作為依托。而在PCR過程中擴增效率的影響因素諸多，難以滿足高準確度的定量。ELISA等免疫學方法特異性取決于抗原的制備，應用范圍受到限制；加熱過程會破壞蛋白質結構中的抗原決定簇，導致檢測結果出現(xiàn)假陰性；各種商業(yè)化的ELISA試劑盒只能用于定性和半定量，并不能準確地定量芝麻過敏原。因此開發(fā)精準的定量檢測技術將成為檢測方法的發(fā)展方向。MS技術結合蛋白質組學方法能夠在肽段水平和蛋白水平實現(xiàn)蛋白的定量，不依賴抗原抗體的制備；所檢測的特征肽段穩(wěn)定性高，幾乎不受加工過程的影響；并且所選特征肽段與過敏原抗原表位重合，可進一步說明食物的致敏性?；贛S技術的定量蛋白質組學在過敏原的檢測方面具有廣闊的應用前景。

另一方面，對過敏原結構、致敏和脫敏機制等的研究也不斷深入發(fā)展。不同的加工方法能夠改變過敏原蛋白的各級結構、可以直接影響其致敏性；結構改變也可以影響蛋白聚集性，消化吸收性等，間接影響蛋白的致敏性。結構的改變有可能掩蓋或者破壞過敏原表位，降低致敏性；也有可能引起聚集，形成新的免疫反應性結構，增強過敏原的潛在致敏性。結構變化導致的消化吸收能力的改變，可能因為抗原表位的破壞或者暴露而引起致敏性降低或者增強。目前，對于芝麻過敏原蛋白結構變化和致敏性變化之間的關系和機理還未被闡明，需要更為深入且全面的研究，從而揭示加工中過敏原蛋白結構聚集、交聯(lián)或裂解等變化，探討抗體與抗原的動力學反應，致敏性的變化規(guī)律；為采用不同工藝或方法定向消除或降低食品過敏原的致敏性提供理論參考，也為過敏原標簽標識的實施提供理論依據。