史小東，鄭金旭，錢海，楊磊，孫金玲

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明、進(jìn)展迅速、不可逆、預(yù)后極差的慢性肺疾病。生長因子及其胞內(nèi)的下游信號通路等多種因素可以促進(jìn)纖維化的進(jìn)展［1］。IPF過程中肺組織損傷及其生理功能異常的特點是肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），形成遷移能力強(qiáng)的間充質(zhì)類細(xì)胞。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的最經(jīng)典生長因子之一［2］。發(fā)生EMT時上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白等表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等表達(dá)上調(diào)［3］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞代謝、生長、增殖和凋亡的信號途徑之一。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路異常與肺纖維化發(fā)生有關(guān)［4］。Nistala等［5］研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生IPF時組織細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路活化，但具體機(jī)制尚不明確。

柴胡皂甙D（saikosaponins D，SSd）是從中藥柴胡中提取分離出來的有效成分，具有抗纖維化、抗炎、抗腫瘤等作用［6-7］。SSd治療肺纖維化小鼠模型可取得與激素類似的療效［8］，但具體作用機(jī)制，尤其是否通過相關(guān)信號通路而阻斷EMT尚不明確。本實驗通過TGF-β1刺激體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞建立EMT模型，并予SSd干預(yù)，檢測細(xì)胞內(nèi)mTOR、p70S6及EMT發(fā)生時α-SMA、N-鈣黏蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、E-鈣黏蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探討SSd經(jīng)mTOR通路對EMT過程的可能影響。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細(xì)胞肺腺癌A549細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。SSd（南京靈寶生物科技公司）；重組TGF-β1、p-mTOR、p70S6兔來源多克隆抗體、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白（CST公司）；Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA（武漢博士德生物工程公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肺癌細(xì)胞株A549置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于5%CO2、37℃條件下，每2天換1次培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 SSd的配制

將20 mg SSd用780μL DMSO稀釋為終濃度2 mmol／L的濃縮液。實驗使用時予RPMI 1640工作液稀釋至需要濃度。

1.4 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，分為5組，用胰蛋白酶常規(guī)消化，離心收集細(xì)胞沉淀。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸制成細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至1×104／mL，接種于96孔板中，每孔加入100μL，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后，改用無血清DMEM培養(yǎng)液，饑餓細(xì)胞12 h。其中4組加入TGF-β1（10 ng／mL）4μL刺激A549細(xì)胞24 h后，再予不同終濃度SSd（0、0.5、1.0、2.0μmol／L）作用24 h。培養(yǎng)結(jié)束后分別每孔加入20μL MTT溶液，置37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，棄去培養(yǎng)液。每孔加入100μL DMSO，振蕩20 min，使紫色結(jié)晶物甲臜液溶解充分后在酶聯(lián)免疫儀上490 nm波長測定光密度（D）值。在相同條件下重復(fù)實驗3次，對照組也以同樣方法進(jìn)行測定。

1.5 蛋白質(zhì)印跡檢測mTOR信號通路及EMT相關(guān)蛋白

1.5.1 細(xì)胞處理及蛋白提取 分別取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，常規(guī)消化細(xì)胞接種6孔板，以10 ng／ml的TGF-β1刺激24 h，用不同濃度（0.5、1.0、2.0 μmol／L）的SSd溶液作用于細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1～2遍，吸干PBS后加入100μL煮沸的2×SDS-上樣緩沖液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入1.5 mL離心管中，干式恒溫器100℃煮沸蛋白5 min，再用超聲儀破碎細(xì)胞10 s，于4℃，12 000×g離心5 min，-20℃冰箱待檢。

取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，常規(guī)消化細(xì)胞接種6孔板，以10 ng／mL的TGF-β1刺激24 h，再用1 μmol／L SSd溶液作用于細(xì)胞8 h、12 h、24 h后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞1～2遍，吸干后按上述方法提取蛋白。

1.5.2 蛋白質(zhì)印跡 根據(jù)上述分離蛋白分子質(zhì)量的大小，配制相應(yīng)濃度的分離膠及濃縮膠。加樣后，濃縮膠以70 V恒壓積聚蛋白，再以120 V電壓在分離膠中分離蛋白。電泳結(jié)束后將PVDF膜貼于目標(biāo)蛋白對應(yīng)大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流350 mA、4℃、2 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用含5%BSA的封閉緩沖液室溫封閉1 h。按說明書要求稀釋抗體并室溫孵育一抗mTOR、p70S6、α-SMA、N-鈣黏蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、E-鈣黏蛋白抗體及內(nèi)參β-肌動蛋白（1∶1 000）4 h，然后用TBST洗滌膜3次。用TBST按1∶5 000的比例稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，置搖床室溫孵育1 h，快速洗膜3次。最后在膜表面加入曝光液后于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中掃描條帶。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SSd抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，TGF-β1（10 ng／mL）刺激A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的增殖能力顯著上升（t＝0.000 214，P＜0.05）。與TGF-β1刺激組比較，TGF-β1+SSd組細(xì)胞增殖能力明顯降低，且隨著SSd劑量的增加，抑制效果逐漸增強(qiáng)（F ＝67.33，P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度SSd對TGF-β1作用下A549細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 不同濃度SSd作用后TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，不同濃度SSd溶液（0.5，1.0，2.0μmol／L）作用后，TGF-β1（10 ng／mL）刺激的A549細(xì)胞E-鈣黏蛋白明顯升高（F＝53.7，P＜0.05），N-鈣黏蛋白（F＝90.22，P＜0.05）、α-SMA（F＝154.01，P＜0.05）、Ⅰ型膠原蛋白（F＝29.88，P＜0.05）表達(dá)水平明顯下降。表明SSd可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞發(fā)生EMT，且呈濃度依賴性。見圖2。

同時TGF-β1作用后A549細(xì)胞p70S6蛋白、pmTOR表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05），表明TGF-β1促進(jìn)A549細(xì)胞EMT發(fā)生同時磷酸化激活mTOR。經(jīng)不同濃度SSd（0.5，1.0，2.0μmol／L）作用后，TGF-β1刺激的A549細(xì)胞p70S6（F＝101.44，P＜0.05）、pmTOR蛋白（F＝13.84，P＜0.05）的表達(dá)隨SSd濃度的增加而逐漸降低。見圖2。

圖2 不同濃度SSd抑制TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3 SSd作用不同時間點TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

A549細(xì)胞經(jīng)TGF-β1（10 ng／mL）刺激24 h發(fā)生EMT，選擇1μmol／L的SSd作用8，12，24 h后，p70S6（F＝24.47，P＜0.05）、mTOR（F＝24.00，P＜0.05）蛋白的表達(dá)隨時間變化逐漸降低，表明mTOR磷酸化及其下游信號通路的激活受到抑制；間質(zhì)化指標(biāo)α-SMA（F＝19.72，P＜0.05）、Ⅰ型膠原蛋白（F＝49.53，P＜0.05）表達(dá)顯著下降，表明SSd同時逆轉(zhuǎn)了EMT過程（圖3）。

圖3 SSd作用不同時間點TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

人肺腺癌A549細(xì)胞屬上皮來源細(xì)胞，具有穩(wěn)定的肺泡上皮細(xì)胞的特征，廣泛用于體外Ⅱ型肺上皮細(xì)胞藥物代謝的模型。IPF病理特點是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生，肌纖維母細(xì)胞聚集及肺組織結(jié)構(gòu)重塑。目前認(rèn)為，IPF是起源于肺泡上皮反復(fù)發(fā)生微小損傷的異常修復(fù)。在損傷修復(fù)時肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞異常激活產(chǎn)生多種生長因子和趨化因子誘導(dǎo)固有成纖維細(xì)胞增生，趨化循環(huán)纖維細(xì)胞到肺臟損傷部位，刺激EMT和成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞［9］。肌成纖維細(xì)胞增生分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），導(dǎo)致纖維瘢痕形成、肺結(jié)構(gòu)破壞、肺功能喪失，促進(jìn)IPF的進(jìn)展。在此過程中伴有TGF-β1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素如IL-8、IL-31、IL-32等多種細(xì)胞因子的異常增多，以及TGF-β1／Smads、Wnt／β-catenin等信號通路的異常激活［10］。關(guān)于mTOR信號通路的相關(guān)研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，mTOR信號通路異常也參與EMT過程［11］。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K／AKT／mTOR信號通路能調(diào)控Snail轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生［12］。另有研究表明，TGF-β1通過激活PI3K／AKT／mTOR信號通路誘導(dǎo)SPC-A1細(xì)胞EMT，從而促進(jìn)Snail進(jìn)入細(xì)胞核［13］。

阻斷EMT過程是預(yù)防、治療IPF的方法之一。IPF的治療除了肺移植外，目前尚缺乏令人滿意的治療藥物。雖然抗纖維化新藥吡啡尼酮已經(jīng)上市應(yīng)用［14］，但治療作用及效果還需大規(guī)模及長時間的臨床觀察，且費用昂貴。SSd有較強(qiáng)的抗炎、抑制血管生成、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，且毒副作用小、安全性高。

本研究用TGF-β1刺激A549細(xì)胞建立EMT模型，其α-SMA表達(dá)增加、p-mTOR表達(dá)增強(qiáng)，且其下游p70S6蛋白水平也升高。表明A549細(xì)胞經(jīng)TGFβ1刺激發(fā)生EMT，同時細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路活化。此外，不同濃度SSd處理后TGF-β1刺激的A549細(xì)胞p70S6蛋白表達(dá)水平降低，間質(zhì)細(xì)胞特征性指標(biāo)α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、N-鈣黏蛋白也降低，上皮細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)E-鈣黏蛋白則升高，呈明顯劑量—時間依賴關(guān)系。由此可見，SSd可抑制TGFβ1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞發(fā)生EMT，其機(jī)制可能是抑制了mTOR通路的活化，使ECM表達(dá)減少。本研究結(jié)果為阻止IPF形成，阻斷EMT過程提供了新靶點，也為SSd用于臨床肺纖維化治療提供了理論依據(jù)。