倪道斌，呂宏祥，陳蓉，田雨，張士清，蘇兆亮，許化溪

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013）

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）是模擬自身免疫性炎癥的疾病模型，Th17細(xì)胞在心肌炎的發(fā)生中起重要作用［1-2］。骨髓來源的抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）是一群異質(zhì)性細(xì)胞，為樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的前體，生理情況下能迅速分化為成熟的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞，并進(jìn)入相應(yīng)的器官、組織，發(fā)揮正常免疫功能［3-4］。研究顯示，MDSC在炎癥、腫瘤和自身免疫疾病中增殖和聚集，參與疾病的進(jìn)展［5］。但是，MDSC和Th17細(xì)胞在EAM中的相互作用尚不清楚。吉西他濱是阿糖胞苷類似物，是一種新型的細(xì)胞周期抗代謝物，可以阻止細(xì)胞從G1期向S期的進(jìn)展致細(xì)胞死亡［6-7］，多應(yīng)用于腫瘤和炎癥的治療［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱可通過減少M(fèi)DSC的數(shù)量從而抑制腫瘤的進(jìn)展［11］。但是，吉西他濱在EAM中的作用尚不清楚。本研究擬探討吉西他濱在EAM模型中的作用以及MDSC和Th17細(xì)胞的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

21只6～8 周齡雄性Balb／c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：201807105。SPF條件下適應(yīng)飼養(yǎng)1周，15只用于構(gòu)建EAM小鼠模型，6只用于分選Na?ve CD4+T細(xì)胞和MDSC。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方案均經(jīng)過江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器和試劑

qRT-PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Triozol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green PCR 試劑盒（大連TaKaRa公司）；ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；MDSC分離試劑盒，Na?ve CD4+T細(xì)胞分離試劑盒（德國(guó)Miltenyi Biotec公司）；IL-17A，Gr-1，CD11b流式抗體（美國(guó)BD公司）；豬心肌肌球蛋白（上海生工生物公司）；吉西他濱（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司）；IL-17A引物由上海生工生物公司合成。

1.3 EAM小鼠模型的建立和處理

取1.5 mg豬心肌肌球蛋白，溶于75μL乙腈和150μL冰醋酸，用雙蒸水定容至1.5 mL；將溶液與弗氏完全佐劑按照1∶1體積混合，乳化為1號(hào)均勻的乳濁液，用于建立EAM小鼠模型。分別取50μL乙腈、100μL冰醋酸、850μL雙蒸水，共1 mL，與弗氏完全佐劑按照1∶1體積混合，乳化為2號(hào)均勻的乳濁液，用于注射對(duì)照組小鼠。

將15只Balb／c小鼠分為對(duì)照組，EAM組，EAM+吉西他濱組，每組5只。對(duì)照組：于第1天和第7天背部皮下多點(diǎn)注射2號(hào)乳濁液，每只200μL。EAM組和EAM+吉西他濱組于第1天和第7天背部皮下多點(diǎn)注射1號(hào)乳濁液，每只200μL。EAM+吉西他濱組于第1天開始，給予吉西他濱腹腔注射（50 mg／kg），每3 d注射1次。在第21天，取眼球血，頸椎脫臼處死3組小鼠，取心臟和脾臟組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 Na?ve CD4+T細(xì)胞和MDSC分選及共培養(yǎng)

于超凈臺(tái)中取6只Balb／c小鼠脾臟，經(jīng)篩網(wǎng)研磨得到脾細(xì)胞懸液；用無菌滴管吸入無菌離心管中，經(jīng)ACK裂解紅細(xì)胞后，行500×g離心5 min，棄上清液。按照Na?ve CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒說明書操作，先加適量MACS緩沖液稀釋混勻，加入CD4+T細(xì)胞生物素抗體混勻，4℃孵育5 min；再加入CD4+T微磁珠4℃孵育10 min；用MACS緩沖液濕潤(rùn)柱子，將細(xì)胞懸液加入柱子，收集通過柱子的細(xì)胞，即為Na?ve CD4+T細(xì)胞；標(biāo)記CD4流式抗體，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選的Na?ve CD4+T細(xì)胞純度。

按照MDSC磁珠分選試劑盒說明書操作，用500μL PBE重懸脾細(xì)胞，加入10μL FcR封閉液混勻，4℃靜置30 min；加10μL Gr-1抗體混勻，4℃靜置30 min；加入10 mL PBE，吸管吹打洗滌并吸棄大的雜質(zhì)；4℃行500×g離心10 min；棄上清液，加600μL PBE重懸；加20μL抗生素磁珠4℃靜置30 min；過MS分離柱；最后用PBE將MS分離柱中細(xì)胞壓出得到MDSC，標(biāo)記CD11b，Gr-1抗體后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選的MDSC細(xì)胞純度。

按照MDSC、Na?ve CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒分別分離出MDSC、Na?ve CD4+T細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)分為3組，活化組、誘導(dǎo)組和共培養(yǎng)組?；罨M是經(jīng)CD3抗體和CD28抗體活化Na?ve CD4+T細(xì)胞；誘導(dǎo)組是用IL-6和TGF-β誘導(dǎo)活化Na?ve CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞；共培養(yǎng)組使用誘導(dǎo)分化的Th17細(xì)胞，然后按照MDSC∶Th17＝2∶1比例共培養(yǎng)；培養(yǎng)3 d，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組Th17細(xì)胞比例。

1.5 HE染色觀察心臟組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥評(píng)分

取“1.3”中的心臟組織，4%低聚甲醛固定，石蠟包埋，4μm切片；二甲苯、梯度乙醇水化切片；蘇木精染色2 min，流水沖洗；伊紅染色2 min，流水沖洗；梯度乙醇、二甲苯脫水10 min；中性樹脂封片，晾干，于光鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

根據(jù)Pummerer等［12］提出的4級(jí)標(biāo)準(zhǔn)行炎癥評(píng)分。0分：無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；1分：少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；2分：局灶炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；3分：炎性細(xì)胞浸潤(rùn)10%～30%；4分：炎性細(xì)胞浸潤(rùn)大于30%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中MDSC和Th17細(xì)胞比例

取“1.3”中得到的脾臟組織放入濾網(wǎng)中，加入PBS研磨制備脾細(xì)胞懸液，用ACK裂解紅細(xì)胞；4℃行3 500 r／min離心5 min；棄上清液后分2管，每管加250μL PBS重懸細(xì)胞，一管依次加入Gr-1和CD11b熒光抗體各1μL；另一管加入IL-17A熒光抗體1μL，室溫避光孵育15 min；加入1 mL PBS混勻，4℃行3 500 r／min離心5 min；棄去未結(jié)合的熒光抗體上清液，加入200μL PBS重懸，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDSC和Th17細(xì)胞比例。

1.7 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-17A濃度

取“1.3”中眼球血，常溫靜置30 min，4℃行3500 r／min離心5 min；取100μL血清加入包被好抗體的反應(yīng)孔中，加HRP標(biāo)記的抗體，37℃孵育1 h；洗滌液反復(fù)洗5遍；加底物顯色15 min；加終止液，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本IL-17A濃度。

1.8 組織RNA提取和qRT-PCR檢測(cè)心肌組織IL-17A mRNA的表達(dá)

取“1.3”中的心臟組織1 mg，剪碎后加入1 mL Trizol，按照RNA提取步驟提取組織RNA。用核酸分析儀檢測(cè)RNA濃度和純度。選取濃度大于100 ng／μL，純度D（260 nm）／D（280 nm）位于1.8～2.0的RNA行反轉(zhuǎn)錄。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃保存。將獲得的cDNA作為模板行qRT-PCR檢測(cè)IL-17A mRNA表達(dá)。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性15 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法行相對(duì)定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和制圖，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌炎癥損傷情況

HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EAM組心臟組織中以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，并且可見心肌細(xì)胞壞死；與EAM組相比，EAM+吉西他濱組小鼠心臟組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。心肌炎癥評(píng)分顯示，與對(duì)照組相比，EAM組心臟組織炎癥評(píng)分明顯升高（t＝6.364，P＜0.05）；與EAM組相比，EAM+吉西他濱組心臟組織炎癥評(píng)分明顯降低（t＝4.95，P＜0.05）。見圖1。

2.2 吉西他濱下調(diào)EAM模型鼠脾臟中MDSC和Th17的比例

如圖2所示，與對(duì)照組相比，EAM組MDSC比例明顯增加（t＝12.43，P＜0.05），Th17比例也明顯增加（t＝16.42，P＜0.05）。但與EAM組比較，EAM+吉西他濱組小鼠脾臟中MDSC和Th17比例均明顯降低（t＝22.64，15.52，P均＜0.05）。

圖1 各組小鼠心臟組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況（HE染色）及炎癥評(píng)分

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾臟中MDSC和Th17比例

2.3 MDSC促進(jìn)Na?ve CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與活化組相比，誘導(dǎo)組Th17細(xì)胞比例明顯增加（t＝8.888，P＜0.05），說明IL-6和TGF-β可促進(jìn)活化的Na?ve CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。與誘導(dǎo)組相比，共培養(yǎng)組Th17細(xì)胞比例明顯增加（t＝19.36，P＜0.05），說明MDSC促進(jìn)Na?ve CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Th17細(xì)胞比例

2.4 吉西他濱下調(diào)EAM模型小鼠血清中IL-17A濃度和IL-17A mRNA水平

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，EAM組血清中IL-17A濃度明顯上升（t＝74.36，P＜0.05）；與EAM組比較，EAM+吉西他濱組小鼠血清中IL-17A濃度明顯下降（t＝35.52，P＜0.05）。見圖4。

圖4 ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清IL-17A濃度

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，EAM組心肌組織中IL-17A mRNA表達(dá)量明顯上升（t＝32.00，P＜0.05）。與EAM組比較，EAM+吉西他濱組IL-17A mRNA水平明顯降低（t＝23.27，P＜0.05）。見圖5。

圖5 qRT-PCR檢測(cè)各組IL-17A mRNA表達(dá)水平

3 討論

心肌炎特征表現(xiàn)為心肌細(xì)胞變性壞死和相關(guān)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。心肌炎和其后遺癥擴(kuò)張性心肌病是年輕人心力衰竭發(fā)生猝死的主要原因［13］。既往研究表明，CVB3是北美和歐洲引起病毒性心肌炎最常見的病原體之一［14-15］。EAM在組織學(xué)上與病毒性心肌炎相似，所以研究EAM可以為臨床治療病毒性心肌炎和評(píng)價(jià)預(yù)后療效提供依據(jù)。本研究表明，吉西他濱可抑制EAM小鼠心肌炎癥，但具體機(jī)制還不清楚。既往研究表明，T細(xì)胞尤其是輔助性T細(xì)胞，在心肌炎癥的發(fā)生中起著重要作用［16］；Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞分化的表型，分泌IL-17A和IL-6等炎癥因子進(jìn)而促進(jìn)炎癥的進(jìn)展。Th17細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化等自身免疫疾病的發(fā)展中起重要作用［17-18］。既往研究表明，在EAM急性期，Th1和Th17細(xì)胞增殖并且促進(jìn)炎癥進(jìn)展［19］。本研究結(jié)果表明，與EAM組比較，EAM+吉西他濱組Th17細(xì)胞明顯降低，說明吉西他濱抑制Th17細(xì)胞從而抑制心肌炎。

MDSC是具有免疫抑制功能的未成熟骨髓細(xì)胞的異質(zhì)群體，在小鼠中，MDSC在表型上定義為CD11b+Gr1+細(xì)胞，其進(jìn)一步分類為G-MDSC和MMDSC，前者如CD11b+Ly6G+Ly6Clow細(xì)胞，后者如CD11b+Ly6G-Ly6Chi細(xì)胞［20］。MDSC在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中發(fā)揮顯著的促炎作用［21］。本研究結(jié)果顯示，EAM組小鼠心臟組織中MDSC比例較對(duì)照組明顯增加，說明MDSC促進(jìn)EAM的進(jìn)展。MDSCs在Th17極化條件下以高效方式增強(qiáng)幼稚CD4+T細(xì)胞前體向Th17細(xì)胞的分化，如Th17細(xì)胞數(shù)量顯著增加，IL-17A 濃度升高［22-23］。本研究結(jié)果顯示，MDSC與誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞共培養(yǎng)可以促進(jìn)Na?ve CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，并且吉西他濱可降低小鼠脾臟中MDSC和Th17比例，由此推測(cè)吉西他濱可能通過抑制MDSC進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞，從而抑制心肌炎，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。