王鳴，宋廉，張禮榮，龔愛(ài)華，朱海濤，王冬青

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，江蘇 鎮(zhèn)江212001）

研究表明，低氧微環(huán)境及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種炎癥因子在胰腺癌惡性生物學(xué)行為中起重要作用［1-2］。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是高度保守的核內(nèi)非組蛋白，可從活化的免疫細(xì)胞中主動(dòng)釋放，或者從受損、應(yīng)激及壞死的細(xì)胞釋放［3-4］。研究表明，低氧可促進(jìn)HMGB1被動(dòng)釋放［5］。然而低氧環(huán)境下HMGB1的釋放途徑仍不明確，故本實(shí)驗(yàn)以人胰腺癌細(xì)胞系PaTu8988為研究對(duì)象，探討低氧條件下腫瘤細(xì)胞釋放HMBG1的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胰腺癌PaTu8988細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基，PBS（美國(guó)Hyclone公司）；澳洲胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；兔抗人單抗隆抗體低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1α，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；兔抗人單克隆抗體β-微管蛋白、HSP70，兔抗人多克隆抗體HMGB1（英國(guó)Abcam公司）；鼠抗人單克隆抗體CD9、CD63、CD81，羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗（美國(guó)Santa Cruz公司）；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（碧云天生物科技公司）；超濾離心管100 kD，ECL發(fā)光液（美國(guó)Millipore公司）；外泌體提取試劑盒（美國(guó)Systembio公司）；DAPI溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常氧培養(yǎng)：將人胰腺癌PaTu8988細(xì)胞株用含10%胎牛血清的高糖DMEM，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

低氧培養(yǎng)：將細(xì)胞置于密封的低氧培養(yǎng)盒中，向低氧培養(yǎng)盒里充入低氧混合氣［（1% O2，5% CO2，94% N2），購(gòu)自南大恒通氣體廠］，持續(xù)充入10 min，然后將低氧培養(yǎng)盒轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 外泌體提取

取常氧和低氧培養(yǎng)后的細(xì)胞上清液于50 mL離心管，4℃行2 000×g離心20 min，去除細(xì)胞碎片；取上清液，于高速離心管中，10 000×g離心30 min；取上清液至Millipore超濾管中，1 000×g離心30 min；取上清液，0.22μm濾器過(guò)濾至15 mL離心管中；按照外泌體提取試劑盒1∶5比例加入到濃縮液中，4℃靜置過(guò)夜；1 500×g離心30 min，棄上清液；1 500×g離心5 min；棄上清液后用100～500μL PBS重懸。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集PaTu8988細(xì)胞和上清液，加入蛋白裂解液，提取總蛋白，100℃煮沸5 min；12 000×g離心5 min，所得上清液即為蛋白樣品。以每個(gè)泳道20μL蛋白樣品上樣，行10% SDS-PAGE；將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入一抗，4℃孵育過(guò)夜；次日TBST洗膜3次，每次10 min；二抗37℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光試劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并分析。一抗分別為兔抗人單克隆抗體HIF-1α（1∶1 000），兔抗人多克隆抗體HMGB1（1∶1 000），兔抗人單克隆抗體HSP70（1∶1 000），鼠抗人單克隆抗體CD9（1∶200），鼠抗人單克隆抗體CD63（1∶200），鼠抗人單克隆抗體CD81（1∶200）；內(nèi)參為兔抗人單克隆抗體β-微管蛋白；二抗分別為羊抗兔二抗（均1∶10 000），羊抗鼠二抗（1∶10 000）。

1.5 免疫熒光法檢測(cè)PaTu8988細(xì)胞中HMGB1和CD63的表達(dá)

將蓋玻片自75%乙醇中取出，輕輕放入24孔培養(yǎng)板；將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液接種于培養(yǎng)板中，將蓋玻片完全浸沒(méi)，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜；設(shè)常氧組和低氧組，分別按照常氧和低氧處理；用PBS清洗細(xì)胞玻片1次；以4%低聚甲醛室溫固定20 min；PBST浸洗玻片3次；滴加3%BSA血清，室溫封閉30 min～1 h；棄封閉液，每張玻片滴加兔抗人多克隆抗體HMGB1（1∶1 000）和鼠抗人單克隆抗體CD63（1∶50）一抗混合液（1%BSA配制），放入濕盒，4℃孵育過(guò)夜；PBST浸洗3次，吸干多余液體；滴加Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗混合液（均為1∶200），濕盒中20～37℃孵育1 h；PBST浸洗3次；滴加DAPI，避光孵育10～15 min；PBST洗4次；吸干多余液體，封片液封片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 生物信息學(xué)分析

下載美國(guó)癌癥基因組圖譜計(jì)劃（The cancer genome atlas，TCGA）和高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）GSE16515中胰腺癌患者的臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，分析健康者和患者胰腺組織中HMGB1 mRNA表達(dá)水平。將患者按HMGB1 mRNA表達(dá)水平分組，低于均值為HMGB1低表達(dá)組，高于均值為HMGB1高表達(dá)組，分析并比較兩組患者的生存期。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，胰腺癌患者生存率分析采用Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1在胰腺癌標(biāo)本中的表達(dá)

經(jīng)分析，GSE16515數(shù)據(jù)庫(kù)中共有52例樣本，其中健康胰腺組織樣本16例，胰腺癌組織樣本36例。與健康組織相比，胰腺癌組織中HMGB1 mRNA呈高表達(dá)（t＝4.532，P＜0.01）。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，在胰腺癌患者中，HMGB1高表達(dá)者生存率明顯低于HMGB1低表達(dá)者（n＝182，χ2＝5.493，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析HMGB1的表達(dá)

2.2 低氧不同時(shí)間胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1的含量

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果表明，PaTu8988細(xì)胞在低氧培養(yǎng)6 h時(shí)，HIF-1α表達(dá)最高（P＜0.01）；在低氧培養(yǎng)48 h后，上清液中HMGB1的表達(dá)顯著增多（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)HMGB1表達(dá)量明顯少于低氧培養(yǎng)6，12，24 h（P＜0.05），見(jiàn)圖2。由此表明，低氧誘導(dǎo)下，胞內(nèi)HMGB1釋放到細(xì)胞外。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3 低氧促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞釋放外泌體且外泌體中含有HMGB1

由圖3可見(jiàn)，與常氧組比較，低氧組外泌體的相關(guān)標(biāo)記蛋白如CD9，CD63，CD81，HSP70和HMGB1均顯著高表達(dá)（t分別為6.752，9.528，7.421，11.07，7.538，P均＜0.01）。TEM透射電鏡結(jié)果顯示（圖4），外泌體提取試劑盒所提取的微囊泡具有膜結(jié)構(gòu)，且直徑在100 nm左右。

2.4 低氧條件下HMGB1與外泌體共定位

免疫熒光結(jié)果表明，與常氧相比，低氧狀態(tài)下HMGB1（紅色熒光）與外泌體的標(biāo)記物CD63（綠色熒光）的共定位增多。見(jiàn)圖5。

3 討論

腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。低氧是包括胰腺癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤的共同特征。越來(lái)越多的研究表明，低氧及其誘導(dǎo)釋放的各種炎癥因子與腫瘤的治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及腫瘤干細(xì)胞維持等密切相關(guān)［7-8］。HMGB1主要位于真核細(xì)胞胞核中，因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移速度快而得名［9］。HMGB1在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤組織的惡性程度相關(guān)［10］。本研究的數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)果一致，由此表明，HMGB1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

圖3 外泌體相關(guān)蛋白和HMGB1的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果

圖4 常氧和低氧上清液中外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)（TEM，×46 000）

圖5 常氧和低氧條件下HMGB1和外泌體的共定位

當(dāng)細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，HMGB1主要位于胞核內(nèi)；當(dāng)外界有適當(dāng)?shù)男盘?hào)刺激細(xì)胞時(shí)，HMGB1的賴氨酸殘基被乙?；瘡亩尫诺桨?。目前HMGB1主要有兩種釋放方式，一種是主動(dòng)釋放，如免疫細(xì)胞主動(dòng)釋放HMGB1應(yīng)對(duì)外源性微生物的入侵；另一種為被動(dòng)釋放，即當(dāng)細(xì)胞發(fā)生死亡，如壞死、凋亡、自噬性細(xì)胞死亡等，或者在多種應(yīng)激情況下，如化療、放療、低氧等，都可使得HMGB1被動(dòng)釋放至細(xì)胞外。本研究結(jié)果也證實(shí)低氧可促進(jìn)HMGB1釋放。目前已知參與HMGB1被動(dòng)釋放的通路有PARP1通路，RIP3通路，組織蛋白酶通路，抗氧化酶通路等。這些主動(dòng)或被動(dòng)釋放到胞外的HMGB1參與細(xì)胞的多種過(guò)程，如促進(jìn)細(xì)胞分化［11-13］、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞遷移、組織再生［14］、血管生成［15-16］、細(xì)胞增殖［17］以及死亡［18］等。HMGB1在結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［19］，不但能增強(qiáng)腫瘤對(duì)治療的敏感性，還可在某些抗腫瘤的治療中致腫瘤產(chǎn)生抗性。

外泌體可由各種正常細(xì)胞分泌，如網(wǎng)織細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，也可由腫瘤細(xì)胞分泌。在某些應(yīng)激條件下，外泌體釋放增多，如缺氧、氧化應(yīng)激、pH改變、放療等［20］。研究表明，低氧能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞釋放外泌體［21］。本研究結(jié)果表明，低氧能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞釋放外泌體。外泌體的顯著特征就是會(huì)攜帶大量的核酸和蛋白。本研究結(jié)果顯示，低氧條件下人胰腺癌PaTu8988細(xì)胞釋放的外泌體可以攜帶HMGB1。且有研究表明，在氧化應(yīng)激條件下，羊膜上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體會(huì)釋放HMGB1［22］。但HMGB1是如何轉(zhuǎn)運(yùn)入外泌體及其生物學(xué)功能目前還不清楚，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，低氧會(huì)促進(jìn)人胰腺癌細(xì)胞釋放HMGB1，且可以通過(guò)外泌體途徑釋放。