胡瑞瑋，陳淑芹，白寧寧，張菁，高新雨，嚴(yán)寒，方啟晨

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院糖尿病研究所，上海200233）

WFS1基因于1998年由Inoue等首次發(fā)現(xiàn)，定位于染色體4p16，由8個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)33.4 kb［1］。WFS1基因編碼產(chǎn)物主要為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜糖蛋白wolframin，該蛋白由890個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約100 kD，含9個(gè)跨膜區(qū)，在心臟、腦、胰腺等組織有較高水平表達(dá)［2］。WFS1基因突變可導(dǎo)致Wolfram綜合征，臨床癥狀主要表現(xiàn)為尿崩癥、糖尿病、視神經(jīng)萎縮和耳聾，糖尿病通常為首發(fā)癥狀［3］。Wolfram綜合征患者的壽命中位數(shù)為30歲，60%在35歲以前死亡［4］。目前WFS1基因突變的致病機(jī)制尚未完全闡明，因此，本研究對(duì)Wfs1基因敲除小鼠肝臟的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以探討WFS1基因突變可能的致病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料和數(shù)據(jù)

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／）下載基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE55143。該數(shù)據(jù)由Punapart等［5］于2014年上傳至GEO數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)集使用Mouse Gene 1.0 ST（Affymetrix公司，美國(guó)）表達(dá)譜芯片。從中選取野生型和Wfs1敲除小鼠（16～18周齡雄性C57BL／6小鼠）肝臟組織RNA的全基因表達(dá)譜進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，兩組各有8份重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因分析

通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)基于R語言的交互式網(wǎng)絡(luò)分析工具GEO2R（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／geo2r／），分析GSE55143中野生型和Wfs1敲除小鼠肝臟組織中的差異表達(dá)基因。將P＜0.05、｜logFC｜＞log21.5［logFC為log2（fold change）］作為差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 差異表達(dá)基因的富集分析

采用上海伯豪生物技術(shù)有限公司的在線富集分析網(wǎng)站（http：∥enrich.shbio.com／index／ga.asp）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（Gene Ontology）分析以及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。采用Fisher精確檢驗(yàn)，挑選標(biāo)準(zhǔn)為差異表達(dá)基因數(shù)目≥4，P＜0.05，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05。

1.4 差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將所有差異基因?qū)氲絊TRING 10.5（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes／Proteins）［6］在線工具中（https：∥string-db.org／），并用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化［7］，獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，置信度閾值為0.4，以連接度大于10作為核心基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

通過GEO2R對(duì)GSE55143中野生型和Wfs1敲除小鼠肝臟組織RNA的全基因表達(dá)譜進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，篩選出198個(gè)差異表達(dá)基因。其中，與野生型相比，Wfs1敲除小鼠肝臟組織中有96個(gè)上調(diào)基因，102個(gè)下調(diào)基因。

2.2 差異表達(dá)基因的GO分析

為進(jìn)一步了解這些差異表達(dá)基因的功能，對(duì)上調(diào)及下調(diào)基因進(jìn)行GO富集分析，得到生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分這3個(gè)方面的分析結(jié)果。按富集程度由高到低排序，取前5位列于表1中。富集程度定義：（某個(gè)詞條中的差異基因數(shù)目／總的差異基因數(shù)目）／（數(shù)據(jù)庫(kù)該詞條中總的基因數(shù)目／數(shù)據(jù)庫(kù)中總的基因數(shù)目）。上調(diào)基因主要涉及有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等生物學(xué)過程和分子功能，而下調(diào)基因主要涉及芳香化酶活性等分子功能。

表1 差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG分析

對(duì)上調(diào)及下調(diào)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析后發(fā)現(xiàn)，上調(diào)基因有17條通路富集，而下調(diào)基因有9條通路富集。按富集程度由高到低排序，取前5位列于表2中。

2.4 差異表達(dá)基因的核心基因篩選

通過STRING及Cytoscape軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。結(jié)果顯示蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中共有180個(gè)節(jié)點(diǎn)，最大連接度為35，最小為1，共有26個(gè)核心基因。圓形節(jié)點(diǎn)和連線分別代表基因編碼的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)間的相互作用，相互作用蛋白的數(shù)目和相互作用的綜合評(píng)分則分別通過圓圈大小和連線粗細(xì)表示。以相互作用蛋白的數(shù)目排序，前10位基因?yàn)镠sd3b5、Cyp2b9、Abcg2、Cyp4a12a、Cyp2b13、Lepr、Acaca、Cyp17a1、Cyp7a1、Cyp2c38。

表2 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析結(jié)果

圖1 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

Wfs1基因敲除小鼠表現(xiàn)為血漿胰島素水平低下，葡萄糖耐量受損［8］。然而，只有雄性Wfs1敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的高血糖以及體重減輕［9］。雜合子小鼠在體重和血糖水平方面與野生型之間并無顯著差異［5］。此外，Wolfram綜合征患者絕大多數(shù)都是純合突變或是復(fù)合雜合突變［4］。代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，Wfs1敲除小鼠胰腺和肝臟有更明顯的代謝改變［10］。肝臟是主要的代謝器官，發(fā)揮重要的生理及生化功能。因此，本研究對(duì)雄性Wfs1敲除小鼠的肝臟組織芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，篩選出198個(gè)差異表達(dá)基因，其中有96個(gè)上調(diào)基因，102個(gè)下調(diào)基因。通過GO、KEGG富集分析，以及STRING、Cytoscape軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要集中在脂肪酸生物合成和初級(jí)膽汁酸生物合成這兩個(gè)方面。

脂肪酸生物合成通路表達(dá)增高主要體現(xiàn)在乙酰輔酶A羧化酶1基因Acaca（t＝2.704，P＝1.47×10-2，logFC＝0.715）、乙酰輔酶A羧化酶2基因Acacb（t＝2.201，P＝4.13×10-2，logFC＝0.633）表達(dá)的上升。乙酰輔酶A羧化酶1催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，參與脂肪酸合成；而乙酰輔酶A羧化酶2催化乙酰輔酶A生成的丙二酰輔酶A發(fā)揮對(duì)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1的抑制作用，從而抑制乙酰輔酶A進(jìn)入線粒體進(jìn)行β-氧化［11］。ACACA和ACACB基因的表達(dá)受到碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（carbohydrate response element-binding protein，ChREBP）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory binding protein-1，SREBP-1）等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［11］。高血糖可以增加ChREBP的N-乙酰葡萄糖胺修飾［12］，從而提高ChREBP的蛋白穩(wěn)定性和對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性［13］。胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）可以通過磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶B通路，激活SREBP-1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性［14］。Wfs1敲除小鼠胰島素分泌障礙［15］，但I(xiàn)GF-1表達(dá)增高［16］。本研究發(fā)現(xiàn)ChREBP、SREBP-1的編碼基因Mlxipl（t＝2.651，P＝1.65×10-2，logFC＝0.303）、Srebf1（t＝3.748，P＝1.52×10-3，logFC＝0.680）在Wfs1敲除小鼠中均表達(dá)增高，提示在Wfs1敲除小鼠中，高血糖和IGF-1等代謝變化可能通過ChREBP、SREBP-1等轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)脂肪酸合成通路表達(dá)增高。

初級(jí)膽汁酸由兩條途徑合成，經(jīng)典的合成通路通過膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1編碼蛋白）這一限速酶發(fā)起，旁路途徑由膽固醇 27α-羥化酶（CYP27A1編碼蛋白）發(fā)起，合成膽酸與鵝去氧膽酸這兩種初級(jí)膽汁酸［17］。本研究發(fā)現(xiàn)Wfs1敲除小鼠初級(jí)膽汁酸合成相關(guān)基因表現(xiàn)出下調(diào)。Cyp7a1（t＝-2.546，P＝2.05×10-2，logFC＝-0.754）及其下游的固醇12α-羥化酶基因Cyp8b1（t＝-4.836，P＝1.41×10-4，logFC＝-1.106）在Wfs1敲除小鼠中均明顯下調(diào)；而旁路途徑中，Cyp27a1在Wfs1敲除小鼠肝臟中無明顯變化（t＝-0.319，P＝7.54×10-1），但該通路下游的膽固醇25α7羥化酶基因Cyp7b1（t＝-5.929，P＝1.43×10-5，logFC＝-2.330）表現(xiàn)出了明顯的下調(diào)［18］。近30年的研究表明，膽汁酸除了參與機(jī)體對(duì)食物的消化吸收外，其作為信號(hào)分子可以激活肝臟和胃腸道中特定的核受體，從而對(duì)膽汁酸、葡萄糖、脂肪酸、脂蛋白等的合成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮調(diào)控作用［19］。2型糖尿病患者餐后血漿膽汁酸的濃度、組成與健康對(duì)照相比均發(fā)生明顯變化［20］。膽汁酸可作用于法尼酯衍生物X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1（G-protein coupled bile acid receptor 1，Gpbar1／TGR5）等多種受體發(fā)揮作用［19］。肝臟FXR受體可通過小分子異源二聚體伴侶抑制肝X受體介導(dǎo)的SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄，或通過改變細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量間接調(diào)控SREBP-1c，從而抑制脂肪生成和脂肪酸合成［21］。膽汁酸在糖代謝中也發(fā)揮著重要作用。膽汁酸結(jié)合于腸道L細(xì)胞上的TGR5受體，從而促進(jìn)胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）的分泌；而結(jié)合FXR受體則對(duì)葡萄糖刺激產(chǎn)生的GLP-1分泌發(fā)揮抑制作用［22］。糖尿病大鼠攝入?；悄懰岷?，血漿胰島素及GLP-1水平升高，空腹血糖水平及葡萄糖耐量均有明顯改善［23］。有研究表明，GLP-1受體激動(dòng)劑可以增加Wfs1敲除小鼠的胰島素分泌，改善血糖水平，并降低胰島中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物的水平［15］。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)的方法，對(duì)Wfs1敲除小鼠肝臟組織的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果提示W(wǎng)fs1敲除可能影響肝臟膽汁酸合成，從而進(jìn)一步影響糖脂代謝。針對(duì)膽汁酸的相關(guān)研究，或許能為WFS1突變患者的治療提供新思路。