李魯博，陳波，錢堯，李巧玉

（1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 鎮(zhèn)江212002）

腦缺血會導致顱內(nèi)缺氧，隨著缺血缺氧進展會導致氧糖剝奪／復氧損傷（oxygen-glucose deprivation／reoxygenation，OGD／R）的發(fā)生，并導致神經(jīng)元及血管損傷，同時缺氧也會誘發(fā)自噬［1-3］。研究表明，適度的自噬可在外界環(huán)境刺激下維持細胞穩(wěn)態(tài)，過度自噬則可能導致細胞死亡［4］。腦卒中發(fā)生后，顱內(nèi)會出現(xiàn)缺血缺氧，從而導致自噬的發(fā)生［1］。尼莫地平是一種1，4-二氫吡啶類L-型鈣通道拮抗劑。該藥物具有神經(jīng)保護作用，可改善動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血預后、預防遲發(fā)型缺血性神經(jīng)功能障礙及預防聽神經(jīng)鞘瘤術(shù)后面神經(jīng)和聽神經(jīng)損傷［5-6］。研究表明，尼莫地平可以通過影響凋亡的發(fā)生影響腦卒中的預后［7］，但是未明確說明該藥物有無影響自噬發(fā)生的作用。在腦卒中的發(fā)生過程中，由于自噬的作用，神經(jīng)及血管會受到損傷［3］。關于尼莫地平對腦卒中疾病有無神經(jīng)血管保護作用尚不清楚。因此，本研究制備2種自噬模型：大鼠大腦中動脈局灶性線栓法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型即腦缺血模型，以及星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪（OGD）模型；并將尼莫地平應用到2種模型中，通過蛋白免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、m-TOR／p-mTOR的表達變化，觀察該藥物在腦卒中疾病中的作用，以及其對自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級SD大鼠，雌雄各半，共90只，體質(zhì)量220～250 g；新生SD大鼠（10只，出生3 d內(nèi)），均由江蘇大學動物實驗中心提供［許可證號：SYXK（蘇）2013—0036］。尼莫地平注射液（拜爾醫(yī)藥保健有限公司）；兔抗LC3-Ⅱ抗體、兔抗Beclin-1抗體、兔抗m-TOR抗體、兔抗p-mTOR（S2448）抗體、鼠抗GFAP抗體、抗-GFAP／FITC熒光標記抗體均為美國CST公司產(chǎn)品；氯代三苯基四氮唑（TTC）購自上海玉博科技有限公司；CCK8細胞計數(shù)試劑盒（美國Sigma公司）；多聚賴氨酸（美國Gibco公司）。

1.2 大鼠分組及MCAO大鼠模型制備

將90只SD大鼠均分為3組，分別為尼莫地平組、缺血模型組、假手術(shù)組，每組30只。MCAO模型按照相關文獻方法［8］，以10%水合氯醛（4 mL／kg）麻醉大鼠，在顯微外科手術(shù)顯微鏡下，用眼科剪于大鼠頸部右側(cè)近正中央處切開皮膚，逐層剝離頸部肌肉群及舌下腺，充分顯露頸總動脈及其分支頸內(nèi)、頸外動脈。夾閉頸內(nèi)動脈并結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈遠心段，于頸總動脈近頸內(nèi)動脈處開一小口并插入線栓。手術(shù)完成后，在自然狀態(tài)下，等其蘇醒。在缺血2 h后，取出線栓，行再灌注處理。尼莫地平組及缺血模型組常規(guī)制備MCAO模型，尼莫地平組行1 mg／kg尼莫地平注射液腹腔注射，缺血模型組以等體積的0.9%生理鹽水腹腔注射。假手術(shù)組僅將絲線插入1 cm，以避免阻斷大腦中動脈血流，并同樣給予等體積0.9%生理鹽水腹腔注射。各組分別于造模前1 h、灌注后2 h、4 h行腹腔給藥。

1.3 Zea-Longa評分標準

Zea-Longa評分為常用MCAO大鼠模型判斷方法［9］。評分標準：0分，未見明顯異常，未見神經(jīng)損傷癥狀；1分，將大鼠尾巴提起時，對側(cè)前爪不能完全伸展；2分，大鼠存在向缺血側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為；3分，大鼠損傷側(cè)傾向癱瘓或傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分，無自發(fā)行走，意識喪失。當模型大鼠存在對側(cè)肢體癱瘓、行動異常、部分存在側(cè)向移動的現(xiàn)象時，即為模型制備成功。術(shù)后24 h進行評分，并選取符合2～3分標準的大鼠入組。

1.4 TTC染色檢測各組腦組織梗死體積

按Zea-Longa評分分組后，每組隨機選取3只大鼠；各組大鼠麻醉后，心臟放血并行生理鹽水灌注，隨后迅速取出大鼠腦組織并保持大腦完整，而后于-20℃冰箱中速凍20 min。去除腦膜等多余腦組織，并將冰凍大腦均勻切片。將腦切片置入2%TTC中均勻染色30 min。應用Image J軟件標定出正常組織（紅色）及梗死組織（白色）像素值，與標準比例尺像素值做比較，通過軟件自動計算出相關組織面積。將各腦切片梗死面積（非缺血側(cè)半球面積-缺血側(cè)半球未梗死區(qū)面積）相加后，乘以厚度（2 mm）為總的梗死體積。梗死體積／全腦體積×100%即為腦梗死體積百分比。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin-1和m-TOR／p-mTOR的表達

各組在評分分組后，取出新鮮大腦組織，配置蛋白裂解液，選取大腦基底節(jié)區(qū)缺血半暗帶組織，以超聲細胞破碎儀低溫勻漿，低溫冰柜保存?zhèn)溆?。取制備好的腦組織勻漿，測定蛋白濃度，每孔蛋白上樣量10μL，行SDS-PAGE；將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h；分別滴入兔抗LC3-Ⅱ抗體（1∶400）、兔抗Beclin-1抗體（1∶500）、兔抗p-mTOR抗體（1∶1 000），并以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，4℃孵育過夜；予TBST洗膜5次，每次10 min；以2 mL的羊抗兔IgG二抗（FITC標記，1∶5 000）孵育，室溫緩慢搖動2 h；加ECL顯色劑曝光膠片處理，并用蛋白測定分析軟件計算條帶的光密度值。

1.6 HE染色檢測大鼠腦組織中細胞死亡情況

選取標記好的大鼠，予以水合氯醛麻醉，充分顯露心臟，分別以300 mL生理鹽水及4%低聚甲醛400 mL經(jīng)心尖注入，并由右心耳放血。離斷大鼠頸部，取出大腦組織并固定于4%低聚甲醛中，標記并備用。將組織放入包埋盒中，升梯度濃度乙醇脫水處理，二甲苯透明；放入熔蠟箱中保溫浸泡；待石蠟完全浸入組織后即可冷卻凝固成型。于視交叉后5 mm處開始向后切片至基底節(jié)區(qū)，以3μm厚度開始取材。染色前需脫蠟，二甲苯浸泡，降梯度濃度乙醇浸泡。行蘇木精-伊紅染色，具體過程為蘇木精染液染色10 min；水洗多余染液，1%鹽酸乙醇分色片刻；鏡檢控制，直至細胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，約10 s；流水沖洗15～30 min，蒸餾水洗；0.5%伊紅染液染色5 min；依次經(jīng)70%、85%、95%、100%乙醇脫水，各級為2～3 min；二甲苯透明2次，每次1 min；擦去切片周圍多余二甲苯，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固。

1.7 星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及純化

取新生SD大鼠，心臟放血后，取大腦組織，仔細剔除腦膜、血管、小腦等，取大腦皮層并剪成組織塊，胰酶消化，吹打成細胞懸液，室溫1 000 r／min離心5 min；重懸后并篩網(wǎng)過濾。將細胞接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，每3 d換液1次，培養(yǎng)7～10 d，根據(jù)膠質(zhì)細胞間黏附性不同行星形膠質(zhì)細胞純化。具體方法：將培養(yǎng)瓶置于恒溫振蕩器中，37℃180 r／min振蕩5 h，去除上層細胞；將下層細胞消化、重懸，繼續(xù)置于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。重復上述方法至第4代細胞，方可用于細胞實驗。將純化后的星形膠質(zhì)細胞消化、離心、重懸，5%牛血清白蛋白封閉10 min。PBS洗滌，離心重懸，重復3次。加入1%牛血清白蛋白稀釋的一抗GFAP于4℃孵育過夜。PBS再次洗滌，加入抗GFAP／FITC熒光標記抗體，4℃避光孵育1 h。PBS清洗3次，上流式細胞儀檢測其純度。

1.8 糖氧剝奪實驗模型建立

取純化后的星形膠質(zhì)細胞，待細胞在培養(yǎng)瓶中生長到一定密度后，棄培養(yǎng)液，并加入PBS，將培養(yǎng)瓶置于OGD實驗裝置中，加入N2∶CO2＝0.95∶0.05（v／v）的混合氣體，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.9 CCK8法檢測星形膠質(zhì)細胞活性

選取純化后的星形膠質(zhì)細胞，接種于96孔板，分別設置空白對照組、OGD模型組、尼莫地平組，細胞按常規(guī)培養(yǎng)。待細胞鋪滿孔底90%后，空白對照組無特殊處理，OGD模型組僅制備OGD模型，尼莫地平組于氧糖剝奪模型制備前1 h予5μg／mL尼莫地平預處理。設置5個復孔，分別給予OGD處理0，1、2、4、8 h，每孔加入10μL CCK8試劑，繼續(xù)孵育3 h，采用酶標儀測定各孔光密度（D）。按以下公式計算細胞活性，細胞活性（%）＝［D（加藥）-D（空白）］／［D（0加藥）-D（空白）］×100。D（加藥）：具有細胞、CCK8溶液和尼莫地平預處理／OGD模型孔D值；D（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細胞的孔D值；D（0加藥）：具有細胞、CCK8溶液而沒有尼莫地平預處理／OGD模型孔D值。

1.10 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)行方差齊性檢驗及正態(tài)檢驗后，對各組數(shù)據(jù)行單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)間應用LSD-t檢驗進一步分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Zea-Longa評分比較

由圖1可見，缺血模型組和尼莫地平組Zea-Longa評分均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；其中，缺血模型組評分明顯高于尼莫地平組（t＝2.585，P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織Beclin-1、LC3-Ⅱ、m-TOR／pmTOR蛋白表達

與假手術(shù)組相比，尼莫地平組與缺血模型組LC3-Ⅱ及Beclin-1表達，m-TOR蛋白與p-mTOR表達均明顯增高（P均＜0.05）。與缺血模型組相比，尼莫地平組LC3-Ⅱ及Beclin-1表達明顯下降，m-TOR蛋白及p-mTOR表達明顯增加（P＜0.05）。見圖2。

2.3 腦組織HE染色結(jié)果

由圖3可見，假手術(shù)組腦組織基本形態(tài)結(jié)構(gòu)相對完整；缺血模型組腦組織有散在的空腔結(jié)構(gòu)，間質(zhì)呈水腫態(tài)，存在大量神經(jīng)元變性、壞死；尼莫地平組與缺血模型組比較，缺血灶周圍區(qū)域中壞死灶明顯減少，細胞死亡數(shù)量降低。見圖3。

圖1 各組大鼠Zea-Longa評分比較

圖2 免疫印跡法檢測各組大鼠腦組織中相關蛋白的表達

圖3 3組腦組織病理形態(tài)（HE染色×200）

2.4 腦組織TTC染色結(jié)果

由圖4TTC染色結(jié)果可見，假手術(shù)組未發(fā)生梗死；尼莫地平組及缺血模型組梗死體積均大于假手術(shù)組（P＜0.05）；且缺血模型組梗死體積明顯大于尼莫地平組（t＝3.859，P＜0.05）。

圖4 TTC染色結(jié)果及腦梗死體積百分比

2.5 星形膠質(zhì)細胞細胞活性比較

應用GFAP標記星形膠質(zhì)細胞后行流式細胞術(shù)檢測，星形膠質(zhì)細胞純度為98.36%（圖5）。CCK8實驗表明，隨著時間的推移，OGD模型組中星形膠質(zhì)細胞存活下降，細胞損傷加重；尼莫地平組細胞仍有損傷，但損傷程度低于OGD模型組（圖6）。

圖5 流式細胞儀檢測星形膠質(zhì)細胞純度結(jié)果

圖6 CCK8檢測星形膠質(zhì)細胞活性

2.6 各組星形膠質(zhì)細胞Beclin-1、LC3-Ⅱ、m-TOR蛋白表達

與OGD模型組相比，尼莫地平組LC3-Ⅱ及Beclin-1表達明顯降低，m-TOR蛋白及p-mTOR蛋白表達明顯增加（P均＜0.05）。尼莫地平組及OGD模型組各種蛋白表達程度均明顯高于空白對照組（P均＜0.05）。見圖7。

圖7 各組星形膠質(zhì)細胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ和m-TOR蛋白表達

3 討論

腦卒中發(fā)病部位特殊，對其研究通常依賴于建立相關模型，常用的模型有雙動脈法、四血管法、MCAO法等腦缺血模型。其中前兩種方法操作相對簡單，但疾病模型構(gòu)筑的病理環(huán)境與機體腦卒中存在差異［10］。大腦中動脈是頸內(nèi)動脈最大的分支，也是頸內(nèi)動脈的直接延伸，是人類腦卒中發(fā)病的常見部位［1］。通過頸內(nèi)動脈可以將線栓直接通入大腦中動脈并制造局灶性腦缺血，因此，MCAO模型被廣泛應用［11］。其優(yōu)點有操作創(chuàng)傷小，簡便易行，易于篩選成功模型等；此外，選用MCAO模型更有利于重復實驗，并最大可能地復原人腦缺血疾病相關病理環(huán)境。OGD實驗是在氧糖剝奪后利用其損傷誘發(fā)自噬發(fā)生的一種模型，而星形膠質(zhì)細胞則是顱內(nèi)重要的細胞，利用OGD實驗研究細胞層面自噬的發(fā)生，對研究自噬機制及相關通路有著重要意義［12］。

尼莫地平可特異擴張腦血管、增加冠脈血流量，對外周血管影響較小，在降低血壓同時，保證顱內(nèi)供血，對缺血性腦損傷有保護作用［13］。本研究通過制備MCAO模型并行大腦組織HE染色發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腦組織基本形態(tài)結(jié)構(gòu)相對完整，無明顯梗死缺血；缺血模型組腦組織有散在的空腔結(jié)構(gòu)，間質(zhì)呈水腫態(tài)，存在大量神經(jīng)元變性、壞死。與缺血模型組比較，尼莫地平組缺血灶周圍區(qū)域中壞死灶明顯減少，細胞死亡數(shù)量降低。同時TTC染色結(jié)果也表明，應用尼莫地平處理后，大鼠腦組織梗死體積較單純?nèi)毖俟嘧p傷時要小。由此說明，應用尼莫地平可以降低局部腦缺血所致的神經(jīng)損傷。

自噬是一種細胞自我消亡的過程，主要有兩種自噬分子調(diào)控機制，一種是m-TOR相關的通路，另一種是m-TOR非依賴性通路［14］。Beclin-1是一種自噬相關蛋白，與酵母Atg6分子相類似，在處于惡劣細胞內(nèi)環(huán)境時，Beclin-1的降解物可與Ⅲ型PI3K復合物結(jié)合，影響m-TOR相關通路，促進自噬發(fā)生［15］。LC3-Ⅱ蛋白是自噬指示蛋白，直接反應自噬發(fā)生的程度［16］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，尼莫地平組及缺血模型組Belcin-1及LC3-Ⅱ蛋白表達均明顯升高；與缺血模型組相比，尼莫地平組Belcin-1及LC3-Ⅱ的表達明顯降低。同時OGD模型作為細胞層面的自噬模型同樣證明了星形膠質(zhì)細胞中可以發(fā)生自噬；與OGD模型組相比，尼莫地平組Belcin-1和LC3-Ⅱ表達同樣降低。此外，應用尼莫地平處理后，細胞損傷率有所降低。由此說明，隨著腦卒中的發(fā)生，自噬亦會在腦組織中發(fā)生，應用尼莫地平可抑制自噬發(fā)生。同時，細胞層面的OGD實驗及CCK8實驗也證明，尼莫地平可以提高自噬發(fā)生后星形膠質(zhì)細胞的活性，從而降低自噬對星形膠質(zhì)細胞的損傷。綜上所述，本研究表明，尼莫地平對腦卒中有一定的神經(jīng)保護作用，并存在一定的治療作用，但具體作用機制及是否可以應用于臨床治療仍有待進一步研究。