張春霞，劉晶晶，王 雷，李欣洋，郭 磊，劉亭麗，魏春華，李曉晶，李嘉欣

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2015級臨床學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

異體血液通過采集、檢驗并加工后低溫存儲于血庫中，但隨著體外存儲時間的延長，紅細(xì)胞會發(fā)生形態(tài)、攜氧能力以及能量代謝的改變，這些變化統(tǒng)稱為紅細(xì)胞存儲損傷。存儲損傷可能會導(dǎo)致輸血不良后果，因此目前國內(nèi)外研究中不斷嘗試在紅細(xì)胞保存液中添加各種成份來保護紅細(xì)胞，如抗氧化劑、中藥有效成份等，以期降低紅細(xì)胞存儲損傷，延長血液存儲時間。茶多酚是從茶葉中提取的一種多酚類化合物，具有水溶性和抗氧化性，且性質(zhì)穩(wěn)定。本實驗向現(xiàn)有紅細(xì)胞保存液中添加茶多酚，觀察茶多酚對紅細(xì)胞溶血率的影響，并通過血紅蛋白釋放實驗發(fā)現(xiàn)茶多酚可以降低紅細(xì)胞Hb再釋放，因此推測茶多酚對體外存儲的紅細(xì)胞具有保護作用。

1 對象和方法

1.1對象 本研究得到包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，依據(jù)實驗要求招募健康志愿獻(xiàn)血者40名，并在獻(xiàn)血前與志愿者簽署知情同意書。分別采集20 mL全血，離心去除血漿，4℃保存。主要儀器與制劑有Thermo公司全波長多功能酶標(biāo)儀，美國Eppendorf高速離心機，centrifuge5424；水平電泳槽(DYY-III型)和穩(wěn)壓穩(wěn)流電源(DYY-III9B)，北京市六一儀器廠。茶多酚，西安沛森生物科技有限公司；瓊脂糖G-10(111860)，西班牙進(jìn)口分裝品；淀粉(69023738)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；紅細(xì)胞保存液(MAP)，北京博德桑特輸采血器材科技開發(fā)中心產(chǎn)品；甲醇，氨基黑，四氯化碳，硼酸，冰醋酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1紅細(xì)胞懸液制備 將去除血漿后的紅細(xì)胞(RBCs)分為9組，每組50 μL，第1組重懸于50 μL生理鹽水中；第2～9組依次加入50 μL不同濃度梯度的TP-MAP混合液，其中TP濃度依次為0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL。血紅蛋白釋放實驗根據(jù)本室常規(guī)方法，將配制好的淀粉瓊脂糖混合凝膠鋪在17 cm×17 cm玻璃板上，分別吸取反應(yīng)液8 μL點在1.0 mm×0.2 mm的濾紙條上，在陰極側(cè)距玻璃板邊緣1.5 cm處依次將濾紙插入凝膠，120 V恒壓電泳65 min，停電5 min后再電泳60 min。泳畢，氨基黑10B染色3 h，5 %冰醋酸溶液反復(fù)漂洗至背景無色，觀察結(jié)果，拍照留圖。

1.2.2溶血率測定 將樣品經(jīng)3 000 r/min離心5 min后，吸取上清液，用MAP稀釋6倍，在540 nm處測定吸光度值。以溶血液吸光度平均值為參照吸光值，計算相對溶解度。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 20.0軟件處理，用One-way Anova檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度茶多酚作用后紅細(xì)胞懸液的血紅蛋白釋放比較 隨著茶多酚濃度逐漸升高，到達(dá)生理濃度(0.3 mg/mL、0.4 mg/mL)后，紅細(xì)胞再釋放量逐漸減弱，當(dāng)茶多酚濃度達(dá)到0.5 mg/mL時，再釋放量增多(P<0.05)，茶多酚濃度繼續(xù)升高時，再釋放量又呈現(xiàn)降低趨勢，見圖1、圖2。

2.2紅細(xì)胞相對溶解度 溶血液的50倍MAP稀釋液在540 nm處8次測得的吸光度平均值為0.652，以此為參照吸光值。相對溶解度=吸光值/參照吸光值×100 %。不同濃度茶多酚處理后對紅細(xì)胞膜的作用可見，用不同濃度的茶多酚處理RBCs-MAP懸液，結(jié)果顯示，隨著茶多酚濃度增大，實驗組破膜率變化不大(P>0.05)，實驗組和對照組破膜率均在8.5 %，見圖3。

圖1 不同濃度茶多酚作用后紅細(xì)胞懸液的Hb再釋放

圖2 凝膠電泳圖譜中釋放Hb的半定量分析

1組為RBCs-NS懸液；2～9組為RBCs-TP-MAP懸液，茶多酚濃度依次為0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL

圖3 不同濃度茶多酚處理對紅細(xì)胞膜的相對溶解度

3 討論

紅細(xì)胞中的重要成分Hb作為呼吸載體攜帶氧氣輸送至全身各組織，并參與維持酸堿平衡。紅細(xì)胞無核，主要能量供應(yīng)依賴于糖酵解。在保存過程中，紅細(xì)胞會發(fā)生ATP含量下降、代謝調(diào)節(jié)作用喪失以及膜表面磷脂酰絲氨酸的暴露等存儲損傷[1]。1993年，Paul等研究指出，由于低溫對酶活性抑制而導(dǎo)致ATP和2,3-DPG耗竭以及RBCs生存的變化是導(dǎo)致RBCs存儲損傷主要因素[2]。這些因素可導(dǎo)致活性氧堆積和進(jìn)行性膜過氧化反應(yīng)等膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，由此可見氧化損傷是造成紅細(xì)胞存儲損傷的主要原因。存儲損傷可能會導(dǎo)致輸血的不良后果，因此如何避免或減輕紅細(xì)胞存儲損傷，如何提高紅細(xì)胞保存效果始終是輸血醫(yī)學(xué)研究的熱點。

血紅蛋白釋放實驗(HRT)是我校血紅蛋白實驗室建立的一種簡單有效的研究Hb的實驗方法。2007年，研究小組在利用傳統(tǒng)淀粉-瓊脂糖凝膠進(jìn)行常規(guī)β-地中海貧血患者紅細(xì)胞電泳時發(fā)生斷電，再次通電至電泳結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，從原點處又釋放出一條血紅蛋白條帶，并將其命名為再釋放條帶，而且患者血紅蛋白再釋放量比正常人明顯增多。此后研究組又采集了不同疾病患者的紅細(xì)胞，分別進(jìn)行了再釋放電泳。發(fā)現(xiàn)α-地中海貧血、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥患者、肝內(nèi)膽管癌患者、尿毒癥等患者的血紅蛋白再釋放量均與正常人不同。在體外實驗中，研究小組將血漿中的不同成分分別加入正常人的紅細(xì)胞懸液中，發(fā)現(xiàn)清蛋白、球蛋白、葡萄糖、氨基酸、各種維生素等都可以使Hb再釋放發(fā)生改變。因此研究者推測這項實驗?zāi)軌蜃鳛樵u判紅細(xì)胞或者疾病狀態(tài)的一項檢測指標(biāo)。

茶多酚(TP)作為一種天然抗氧化劑，水溶性強且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。目前國內(nèi)外研究顯示，TP具有清除自由基、抗衰老等作用?，F(xiàn)代茶葉藥理學(xué)的研究表明，TP抗氧化活性強于人們經(jīng)常接觸的抗氧化物維生素E、銀杏提取液和丁基羥基甲苯(BHT)等[3]。本研究將HRT應(yīng)用于觀察TP對紅細(xì)胞氧化損傷的保護作用。當(dāng)TP存在時導(dǎo)致Hb再釋放量降低。再釋放的Hb是與膜結(jié)合的Hb，實驗提示TP的存在可以保護膜的完整性，降低Hb與膜的結(jié)合，因此降低Hb再釋放。TP抑制或清除自由基的作用有兩方面機制：一方面直接與氧自由基作用，清除氧自由基的毒性；另一方面，它作為供氫體，使被氧化的維生素E和巰基恢復(fù)為還原型，發(fā)揮了間接抗氧化作用。因此推測TP通過促進(jìn)和調(diào)動紅細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的活性，間接作用于自由基，從而保護離體紅細(xì)胞免受氧化損傷[4]。不同濃度的TP存在條件下，對紅細(xì)胞溶血率沒有明顯影響，說明在短時間內(nèi)TP對MAP貯存的紅細(xì)胞沒有毒性。但TP對于長時間貯存條件下的紅細(xì)胞是否有明顯毒性、TP是否可以通過抗氧化作用改善紅細(xì)胞保存液性能還有待進(jìn)一步研究。