陳延松，劉先富，張曉靜，高 威，唐經(jīng)緯，陳 晨，陳玉忠，錢(qián) 軍，金功圣，郭 偉

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠233004)

三陰性乳腺癌是乳腺癌分子分型中預(yù)后最差的一種病理類(lèi)型，目前常用的化療藥物針對(duì)這種類(lèi)型的乳腺癌效果不佳。而新型的靶向藥物貝伐單抗以及西妥昔單抗等，治療結(jié)果也取得了一些效果，但仍未得到醫(yī)療界的公認(rèn)。所以針對(duì)三陰性乳腺癌有效藥物的探索一直備受廣大臨床醫(yī)生的關(guān)注[1-2]。

凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins，IAPS)的抑制劑LCL161是人工合成的，類(lèi)似第二個(gè)線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激動(dòng)劑(Second mitochondria-derived activator of caspases，SMAC)的小分子化合物[3-6]。筆者已經(jīng)通過(guò)體外MTT實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證明該藥物能夠促進(jìn)人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株細(xì)胞的凋亡[7]。目前已有的研究提示該藥具有促進(jìn)凋亡的作用，但是針對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的促凋亡機(jī)制仍未闡明，本研究旨在證實(shí)LCL161能夠促進(jìn)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，并進(jìn)一步研究其促進(jìn)凋亡的機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象與材料 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。LCL161購(gòu)自Active Biochemicals(中國(guó)香港)公司。線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)購(gòu)自海門(mén)碧云天生物技術(shù)研究所；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法 線粒體膜電位的檢測(cè)(JC-1)細(xì)胞凋亡，配制MDA-MB-231細(xì)胞單細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加LCL161試劑0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按照說(shuō)明書(shū)操作。使用倒置熒光顯微鏡采集圖像。免疫印跡法(western-blot)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)，按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃3孔每組分別加入不同濃度LCL161，達(dá)到作用時(shí)間點(diǎn)后，收集細(xì)胞，每3孔細(xì)胞加100μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，-20°C保存?zhèn)溆?。提取上清進(jìn)行蛋白定量后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，蛋白封閉，分別孵育一抗、二抗，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膜進(jìn)行曝光獲取圖像。

2 結(jié)果

2.1JC-1單體和多聚體實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)JC-1實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)隨著LCL161濃度的增加，紅色熒光逐漸減弱(圖1上行)，而綠色熒光逐漸增強(qiáng)(圖1下行)。說(shuō)明隨著LCL161濃度的增加，JC-1單體逐漸增多，而JC-1多聚體逐步下降，線粒體電位呈逐步下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度LCL161對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位的影響(×100)

2.2不同濃度和時(shí)間段凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)可以觀察到，隨著LCL161的濃度逐漸增加，Bax蛋白表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，而B(niǎo)cl-2，Mcl-1蛋白的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，見(jiàn)圖2-a。隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，cIAP1蛋白的表達(dá)呈逐漸減少的趨勢(shì)，但是cIAP2、XIAP的蛋白的表達(dá)變化不明顯，見(jiàn)圖2-b。

圖2 不同濃度LCL161及作用時(shí)間凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2-a為(1μmol/L、2μmol/L)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bax,Bcl-2,Mcl-1)的蛋白表達(dá)，2-b為1μmol/L LCL161在不同時(shí)間段對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(cIAP1、cIAP2、XIAP)的蛋白表達(dá)

3 討論

通過(guò)JC-1實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)隨著LCL161濃度的增加，紅色熒光逐漸減弱，而綠色熒光逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明隨著LCL161濃度的增加，JC-1單體逐漸增多，而JC-1多聚體逐步下降，線粒體電位呈逐步下降趨勢(shì)。結(jié)合前期進(jìn)行的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出結(jié)論：IAPS的抑制劑LCL161能夠促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。

通過(guò)western-blot檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著LCL161的濃度逐漸增強(qiáng)，Bax蛋白表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，而B(niǎo)cl-2、Mcl-1蛋白的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)。隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，cIAP1蛋白表達(dá)呈逐漸減少趨勢(shì)，但是cIAP2、XIAP蛋白表達(dá)變化不明顯。

Bax是促凋亡基因，與Bcl-2同源，而B(niǎo)cl-2屬于抑制細(xì)胞凋亡的抗凋亡基因。Bcl-2是一個(gè)基因家族，其包含多種基因，主要功能是通過(guò)正負(fù)調(diào)節(jié)參與細(xì)胞凋亡。這些基因主要分布在線粒體外膜上，參與內(nèi)源性的凋亡途徑。一般情況下，Bax與Bcl-2兩者的比例是相對(duì)恒定的，當(dāng)細(xì)胞接受到凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，2種蛋白含量發(fā)生變化。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)線粒體存在細(xì)胞生長(zhǎng)因子，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，使Bax/Bax同源二聚體解離，形成更加穩(wěn)定的Bcl-2/Bax異二聚體，抑制細(xì)胞凋亡。如果抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，則Bax蛋白表達(dá)相對(duì)升高，Bax/Bax同源二聚體增多，促進(jìn)凋亡[8-10]。LCL161可能抑制Bcl-2蛋白表達(dá),影響B(tài)ax 與Bcl-2兩者比例，從而起到促進(jìn)凋亡的作用。

Mcl-1是Bcl-2家族蛋白的主要前體成員，其主要通過(guò)其C-末端跨膜結(jié)構(gòu)域定位于線粒體外膜[11]。研究表明MCL-1通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡途徑，對(duì)細(xì)胞的增殖，分化和腫瘤發(fā)生起著重要作用。通過(guò)隔離促凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白BAX和BAK，MCL-1抑制線粒體膜的透化并最終阻止細(xì)胞凋亡。MCL-1受BH3-only蛋白家族(例如NOXA，BIM和PUMA)的負(fù)調(diào)控，其特異性結(jié)合由MCL-1的BH結(jié)構(gòu)域形成的BH3結(jié)合溝，從BAX和/或BAK中置換MCL-1，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-13]?？沟蛲龅鞍譓CL-1的表達(dá)在各種人腫瘤中經(jīng)常升高。因此，MCL-1可以是抗腫瘤治療直接有效的靶點(diǎn)。引起MCL-1耗竭的藥物已被廣泛研究，并用于抗腫瘤治療。目前常見(jiàn)的藥物為各種CDK(Cyclin Dependent Kinase)抑制劑，如flavopiridol、roscov itine和SNS-032，可降低MCL-1水平并誘導(dǎo)多種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞凋亡[14-16]。通過(guò)western-blot檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)LCL161能夠使MDA-MB-231細(xì)胞的MCL-1表達(dá)下調(diào)，起到促凋亡的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制MCL-1對(duì)凋亡多結(jié)構(gòu)域蛋白BAX和BAK的隔離。

IAPs是一種抗凋亡蛋白家族，其包含有多種凋亡抑制蛋白，如cIAP1、cIAP2、XIAP等。LCL161是SMAC類(lèi)似物，進(jìn)入線粒體后可與caspase競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IAPs，去除IAPs對(duì)下游caspase家族的抑制效應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5,17-18]。人類(lèi)IAPS包含1到3個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)(baculoviral IAP repeat，BIR)域，其家族成員cIAP1、cIAP2、XIAP，可通過(guò)BIR結(jié)構(gòu)域直接與caspases結(jié)合，并溶解酶蛋白來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用，并抑制其活性[19-20]。通過(guò)western-blot實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)通過(guò)LCL161作用的細(xì)胞，其cIAP1蛋白表達(dá)呈逐漸減少趨勢(shì)，而cIAP2、XIAP蛋白表達(dá)變化不明顯。LCL161促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是降低cIAP1蛋白表達(dá)，去除IAPs對(duì)下游caspase家族的抑制效應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們可以推測(cè)出LCL161對(duì)乳腺癌細(xì)胞株腫瘤形成的影響可能是由下調(diào)cIAP1、Bcl-2、Mcl-1的表達(dá)，而促進(jìn)其凋亡所引起。而關(guān)于LCL161下調(diào)cIAP1、Bcl-2、Mcl-1表達(dá)的機(jī)制，目前尚未闡明，是下一步研究的方向。