李欣洋，郭 磊，劉亭麗，王 雷，張春霞，劉晶晶，魏春華，李曉晶，李嘉欣,

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2015級臨床學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

茶多酚是從茶葉中提取的一種多酚類化合物，包括黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等[1]。茶多酚主要為黃烷醇(兒茶素)類，兒茶素占60 %～80 %。類物質(zhì)茶多酚又稱茶鞣或茶單寧，是形成茶葉色香味的主要成份之一，也是茶葉中有保健功能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物質(zhì)具解毒和抗輻射作用，能有效地阻止放射性物質(zhì)侵入骨髓，并可使鍶90和鈷60迅速排出體外，被健康及醫(yī)學(xué)界譽(yù)為輻射克星。已有研究表明，茶多酚具有抗氧化作用，主要體現(xiàn)在清除自由基、抗衰老、抗輻射以及防癌等方面[2]。我們向紅細(xì)胞懸液中添加抗氧化劑茶多酚，觀察其對紅細(xì)胞膜的影響，明確茶多酚是否可通過抗氧化作用保護(hù)紅細(xì)胞。

1 對象與方法

1.1對象及儀器 血液標(biāo)本經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，從包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科取60份健康成人新鮮肝素抗凝靜脈血，4 ℃保存。主要儀器與試劑有高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，全波長多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，水平電泳槽(DYY-Ⅲ型)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電源(DYY-2C)，17 cm×17 cm玻璃板等。茶多酚(西安沛森生物科技有限公司)。EDTA、乙醇、硼酸、四氯化碳、Tris、淀粉、氨基黑、冰醋酸等均為國產(chǎn)分析純；瓊脂糖，西班牙進(jìn)口分裝。

1.2方法

1.2.1紅細(xì)胞懸液的制備 將采集后的血液濾白、離心去血漿，分別用終濃度為0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL的TP-NS溶液與紅細(xì)胞作用3 h后進(jìn)行HRT，離心后的上清液進(jìn)行溶血率測定。以未加TP-NS處理的0 mg/mL組為對照組，參照溶血率值以生理鹽水和溶血液的50倍稀釋液，在540 nm處吸光值為參照。溶血率=(吸光值-生理鹽水吸光值)/(溶血液吸光值-生理鹽水吸光值)×100 %。

1.2.2血紅蛋白釋放實(shí)驗(yàn) 依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制備淀粉瓊脂糖凝膠，分別取反應(yīng)液10 μL點(diǎn)到1 cm×0.2 mm濾紙條上，并插入到凝膠中，120 V電泳1 h后，斷電5 min，再次通電電泳1 h后將膠板置于氨基黑10B中染色，次日用50 g/L冰醋酸溶液反復(fù)漂洗至背景無色，晾干后觀察結(jié)果并拍照。利用Bandscan 5.0軟件做區(qū)帶灰度掃描。

1.2.3紅細(xì)胞溶血率檢測 取各組上清液100 μL/組，分別用生理鹽水稀釋6倍后，測定540 nm處的吸光度，測平行標(biāo)本4個/組。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用One way Anova比較組間均數(shù)差別，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度TP作用后紅細(xì)胞Hb再釋放比較 電泳結(jié)果表明，與未加茶多酚的對照組(0 mg/mL)比較，各濃度茶多酚均可以使Hb再釋放減少，隨著TP濃度增高(0.3 mg/mL)，紅細(xì)胞Hb再釋放量逐漸減少，濃度達(dá)到0.4 mg/mL時，再釋放量增多，超過0.5 mg/mL后，再釋放量又呈降低趨勢(圖1、圖2)。

圖1 不同濃度TP作用后凝膠電泳圖譜和釋放Hb的半定量的分析

2.2紅細(xì)胞溶血率 不同濃度TP作用紅細(xì)胞后的溶血率變化用等體積0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL不同濃度TP作用紅細(xì)胞3 h后抽取上清液，結(jié)果顯示紅細(xì)胞溶血率變化不明顯(P>0.05)，見圖2。

圖2 不同濃度TP處理紅細(xì)胞對紅細(xì)胞膜的溶血率

3 討論

自由基在正常組織細(xì)胞的生存和代謝中不斷地產(chǎn)生，正常情況下，其產(chǎn)生和清除可維持低水平的、有利無害的平衡。在某些情況下，這一平衡被打破，自由基濃度超過生理限度，過量的自由基就介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化作用造成機(jī)體各種損傷[3]。由于紅細(xì)胞本身特別易受氧化損傷，其抗氧化能力強(qiáng)弱及被氧化程度與整個機(jī)體的抗氧化能力及機(jī)體多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。過氧化損傷可以導(dǎo)致紅細(xì)胞酶活性降低、形態(tài)改變、攜氧能力降低等不良反應(yīng)，進(jìn)而影響人體健康。前期的體外實(shí)驗(yàn)研究表明，茶多酚對離體紅細(xì)胞的氧自由基損傷有較強(qiáng)的抑制作用[4]。茶多酚可保護(hù)黃嘌呤氧化酶、過氧化氫和紫外線照射等自由基產(chǎn)生體系誘導(dǎo)的紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，維持紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性和正常功能[5]。

紅細(xì)胞血紅蛋白釋放試驗(yàn)是將未裂解的完整紅細(xì)胞懸液借助濾紙片加在淀粉-瓊脂糖混合凝膠中進(jìn)行電泳，電泳過程中經(jīng)過通電-斷電-再通電，就會出現(xiàn)Hb再釋放條帶[6]。本實(shí)驗(yàn)將HRT技術(shù)應(yīng)用于茶多酚對紅細(xì)胞的保護(hù)作用，研究結(jié)果表明，添加茶多酚可以使紅細(xì)胞Hb再釋放含量降低，且溶血率測定結(jié)果表明采用不同濃度范圍的茶多酚對紅細(xì)胞沒有明顯的破壞作用。該結(jié)果提示茶多酚能通過抗氧化作用保護(hù)紅細(xì)胞。但茶多酚是否可以保護(hù)紅細(xì)胞的形態(tài)、是否影響紅細(xì)胞能量代謝和攜氧能力，還需要進(jìn)一步研究。