方 雷,羅瀟瀟,陳光悅,孟 興,丁 見,繆化春

(1.皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院2015級,安徽 蕪湖 241002;2.皖南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室)

在我國腦缺血疾病(ischemic cerebral disease)發(fā)病率目前呈不斷上升的趨勢，腦缺血發(fā)生后由于血液供給急劇減少，細(xì)胞能量供給匱乏，導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)胞腫脹、壞死[1]，危害較大且無有效的治療方法，研究其中的機(jī)制具有重大意義。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子的典型代表之一可促進(jìn)神經(jīng)元生長及分化，具有維持神經(jīng)元的存活、發(fā)育及修復(fù)受損神經(jīng)元作用[2]。另外，生長休止特定蛋白7(growth arrest-specific protein 7,Gas7)介導(dǎo)NGF誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化的過程[3]。關(guān)于Gas7在受損神經(jīng)元的表達(dá)中所起的作用，目前尚不明確。

電針治療可以促進(jìn)腦部功能的改善，控制和調(diào)整信息的傳出[2]，有研究指出針灸對治療腦缺血具有獨(dú)特的優(yōu)勢，其對腦缺血后神經(jīng)、血管再生具有顯著的臨床效應(yīng)[4]，但機(jī)制尚不完全清楚，基礎(chǔ)性研究仍在不斷深入與拓展中。杏仁核屬于邊緣系統(tǒng)，對應(yīng)激反應(yīng)很敏感，受損后可致恐懼學(xué)習(xí)、記憶缺失和情感記憶障礙[5]。目前尚未見關(guān)于電針對局灶性腦缺血大鼠基底外側(cè)杏仁核(Basolateral amygdala,BLA)前部Gas7和NGF表達(dá)影響的報道。實(shí)驗(yàn)采用尼氏染色、免疫組織化學(xué)染色法檢測大鼠患側(cè)BLA前部Gas7和NGF的表達(dá)。目的在于探討電針對于局灶性腦缺血大鼠的影響及與Gas7和NGF表達(dá)及修復(fù)再生的關(guān)系，為臨床提供腦缺血治療的相關(guān)基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組 成年雄性SD大鼠24只，體重(220.0±20.0)g，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)14 d后隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組和電針組，每組6只。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的操作和處理嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的有關(guān)規(guī)定。

1.2主要試劑與儀器 戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)，多聚賴氨酸Poly-L-ly-sine(武漢博士德生物工程有限公司)，30 %過氧化氫稀釋液(天津市百世化工有限公司)，PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)，Gas 7(美國Sigma公司)和NGF抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根生化科技有限公司)，華佗牌電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(型號：RM2235，德國Leica公司)，BX51顯微鏡、Express C圖像分析系統(tǒng)(日本，OLYMPUS)。

1.3造模方法 參照文獻(xiàn)[6]用線栓大鼠右側(cè)大腦中動脈(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法復(fù)制局灶性腦缺血動物模型。大鼠按照30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，麻醉后取仰臥位將大鼠綁在手術(shù)臺上，備好結(jié)扎動脈的線再剪去頸前的鼠毛，用碘伏消毒，沿頸部正中切開皮膚，繼續(xù)鈍性分離皮下組織，分離到氣管前肌后沿右側(cè)胸鎖乳突肌腱向下分離，見到頸總動脈后可向上拉鉤、分離動脈鞘，分離出頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總、頸外動脈，夾閉頸內(nèi)動脈，用顯微剪將頸總動脈剪一小口、插入魚線(1.8±0.5)cm、結(jié)扎頸總動脈、縫合。等大鼠清醒后，若出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)、提尾時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈，即造模成功。

1.4治療方法 造模成功后，各組大鼠均于恒溫(22 ℃～25 ℃)條件下飼養(yǎng)。正常對照組、假手術(shù)組和模型組大鼠給予常規(guī)飼養(yǎng)；對電針組大鼠按30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，麻醉成功后將大鼠側(cè)臥位放置，對“足三里”穴和“百會”穴，用頻率2 HZ、強(qiáng)度3 V、波寬1 ms的連續(xù)波連續(xù)電針治療14 d，1次/d，30 min/次。

1.5組織取材 電針結(jié)束后按30 mg/kg對各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，分別備好已吸入100 mL生理鹽水和300 mL已過濾的多聚甲醛固定液的吊瓶，麻醉后從劍突下剪開胸腔暴露膈肌，剪開膈肌與兩側(cè)肋，暴露心臟，剪開左心耳，從心尖處插入裝有100 mL生理鹽水的吊瓶針至主動脈弓，先注入100 mL生理鹽水，再注入300 mL已過濾的多聚甲醛固定液(前100 mL快速注入，剩余200 mL緩慢注入)固定后取腦，將取出的腦組織放入4 ℃,4.0 %多聚甲醛固定液浸泡24 h，再經(jīng)過脫水、石蠟包埋后將組織塊放入4 ℃冰箱，連續(xù)切片收集后放入4 ℃冰箱保存以便后續(xù)使用。

1.6尼氏染色 切片5 μm常規(guī)脫蠟(二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ15 min、梯度酒精脫水100.0 %Ⅰ、100.0 %Ⅱ、95.0 %、85.0 %、70.0 %各5 min)、蒸餾水洗3次(各5 min)，置于37 ℃溫箱用1.0 %甲胺藍(lán)染色6 min、蒸餾水洗凈、置于95.0 %酒精脫水5 s、中性樹膠封片。

1.7免疫組織化學(xué)方法及實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的觀察及檢測 切片脫蠟后放入枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行抗原微波熱修復(fù)，滴加3.0 %過氧化氫室溫放置10 min(避光)滅活內(nèi)源性酶，滴加5.0 %BSA封閉液放入37 ℃溫箱60 min，滴加一抗Gas7(1∶100)、NGF(1∶150)放入4 ℃冰箱18 h，取出放入37 ℃溫箱1 h后滴加二抗生物素化兔抗山羊IgG(1∶100)、羊抗兔IgG(1∶100)，放入37 ℃溫箱2 h，滴加SABC放入溫箱1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，流水沖洗，自然晾干后放入100.0 %二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各5 min后中性樹膠封片，各步驟之間均用0.02 mol/L的PBS(pH7.2～7.4)沖洗3次。結(jié)合顯微鏡、大鼠腦立體定位圖譜、圖像分析系統(tǒng)對右側(cè)BLA前部的Gas7和NGF的免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行拍照、計數(shù)，并統(tǒng)計平均灰度值。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析 光鏡下可見經(jīng)尼氏染色的正常對照組和假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)完整、排列規(guī)則、胞核清晰，模型組和電針組神經(jīng)元細(xì)胞層次明顯紊亂、數(shù)量增多、部分胞質(zhì)萎縮。其中電針組較模型組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增加，萎縮神經(jīng)元明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠右側(cè)BLA前部陽性神經(jīng)元的表達(dá)(尼氏染色法，×400)

2.2Gas7的表達(dá) 在光學(xué)顯微鏡下可見切片上大鼠右側(cè)BLA前部有胞膜和胞漿呈棕黃色的Gas7陽性神經(jīng)元。假手術(shù)組Gas7陽性神經(jīng)元數(shù)量和平均灰度值與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組Gas7陽性神經(jīng)元數(shù)量與正常對照組相比增加(P<0.05)，而染色明顯加深、平均灰度值降低(P<0.05)；電針組Gas7陽性神經(jīng)元數(shù)量與模型組相比增加(P<0.05)，而染色明顯加深、平均灰度值降低(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 各組大鼠右側(cè)BLA前部Gas7的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色法，×400)

2.3NGF的表達(dá) 在光學(xué)顯微鏡下可見切片上大鼠右側(cè)BLA前部有胞膜和胞漿呈棕黃色的NGF陽性神經(jīng)元。假手術(shù)組NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量和平均灰度值與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量與正常對照組相比明顯增加(P<0.05)，而染色明顯加深、平均灰度值降低(P<0.05)；電針組NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量與模型組相比明顯增加(P<0.05)，而染色明顯加深，平均灰度值降低(P<0.05)。見圖3、表1。

圖3 各組大鼠右側(cè)BLA前部NGF的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色法，×400)

表1 各組大鼠右側(cè)BLA前部Gas7和NGF免疫陽性細(xì)胞數(shù)及灰度值

注：a表示與正常對照組比較P<0.05；b表示與模型組比較P<0.05

3 討論

在我國腦血管病已成為致死、致殘率較高的疾病之一，其中缺血性腦血管病約占80.0 %[7]，其危害性更大。現(xiàn)存缺血性中風(fēng)患者中，有一半以上的患者初次發(fā)病在50歲以前，即中青年人群，且有年輕化的趨勢[8]。目前腦缺血尚無有效的治療方法，且愈后較差，嚴(yán)重地影響著人們的工作能力及生活質(zhì)量，給個人、家庭和社會帶來極大的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此盡快找到腦缺血的最佳治療方案成為當(dāng)務(wù)之急。目前對于腦缺血的防治手段主要包括藥物治療和針刺治療，目前西藥治療已取得一定效果，但不良反應(yīng)較多，且價格較為昂貴，加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，難以進(jìn)行長期正規(guī)治療，而針刺治療經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且對腦缺血后神經(jīng)元的再生修復(fù)以及突觸的可塑性調(diào)節(jié)取得了明顯效果[9]。本研究中的尼氏染色結(jié)果顯示正常對照組和假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)量較少，模型組神經(jīng)元細(xì)胞與正常對照組和假手術(shù)組相比數(shù)量增多、部分胞質(zhì)萎縮。據(jù)此推斷本實(shí)驗(yàn)造模成功，可用于電針治療。

Gas家族的基因均與細(xì)胞的生長與分化有密切關(guān)系，Gas7是其中的一員，首次發(fā)現(xiàn)于成纖維細(xì)胞，較多的表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)，有研究表明Gas7與神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)、傳導(dǎo)有關(guān)，對外周神經(jīng)元的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用[10]。Gas7對受損神經(jīng)元有保護(hù)作用，在慢性復(fù)合應(yīng)激模型中可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化等，從多方面參與了神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠右側(cè)BLA前部的Gas7陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯多于正常對照組和假手術(shù)組，平均灰度值相較于正常對照組和假手術(shù)組降低，表明Gas7在缺血后的BLA前部表達(dá)增強(qiáng)，這種結(jié)果說明Gas7可能對于神經(jīng)元的保護(hù)及修復(fù)具有一定的作用，但機(jī)制尚不清楚，有待研究。

哺乳動物體內(nèi)有四種神經(jīng)生長因子，分別是：NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5[12]，神經(jīng)生長因子NGF是神經(jīng)生長因子家族中的一員，有研究指出在神經(jīng)元的損傷修復(fù)期，NGF能促進(jìn)成神經(jīng)纖維的定向生長，誘導(dǎo)軸突樹突的發(fā)育[12]，且神經(jīng)生長因子NGF是目前唯一可應(yīng)用于臨床的神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)因子。有研究顯示大鼠腦缺血后腦組織中NGF含量可自發(fā)的上調(diào)，與本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠右側(cè)BLA前部的NGF陽性神經(jīng)元表達(dá)較強(qiáng)相一致，推測可能是缺血誘發(fā)了組織保護(hù)修復(fù)機(jī)制的啟動，但這種含量的增加具有一定的限度，其維持的時間較短，上調(diào)NGF的量較少故不足以對腦缺血形成穩(wěn)定的、有效的、較長時間的保護(hù)作用。所以需要尋找安全、合理、有效、穩(wěn)定的干預(yù)手段來上調(diào)NGF的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對受損神經(jīng)元的保護(hù)。

針刺治療“百會”、“足三里”穴可以益氣行血，通經(jīng)活絡(luò)，短暫高頻刺激下突觸傳遞效率和強(qiáng)度增加數(shù)倍并且能保持這種狀態(tài)數(shù)小時甚至幾天[13]，有利于腦部氣血、肢體功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過頻率2 HZ、強(qiáng)度3 V的電針對MCAO模型大鼠進(jìn)行為期14 d的治療后，結(jié)果顯示尼氏染色檢測電針組萎縮神經(jīng)元較模型組明顯減少，神經(jīng)元數(shù)量增加、層次清晰。免疫組織化學(xué)染色法檢測電針組大鼠右側(cè)BLA前部的Gas7陽性神經(jīng)元和NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量多于模型組，且平均灰度值低于模型組，提示電針治療對于右側(cè)BLA前部Gas7神經(jīng)元和NGF神經(jīng)元的表達(dá)可能具有促進(jìn)作用，Gas7和NGF在電針治療作用下表達(dá)進(jìn)一步提升可能具有腦保護(hù)作用，推測電針對于腦缺血大鼠可能具有治療作用。本實(shí)驗(yàn)對臨床研究局灶性腦缺血的保護(hù)及修復(fù)機(jī)制提供了數(shù)據(jù)參考，豐富了神經(jīng)元再生的研究資料。