白冬雨，張海萍，索文昊，高德宏，鐘山

(廈門大學附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003)

肺癌隨著其發(fā)病率和死亡率的逐年攀升，已躍居惡性腫瘤之首，其中80%以上是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。近年來，以分子靶向治療為核心的個體化治療已成為肺癌治療的研究熱點。目前NSCLC的治療使用最多的是針對表皮生長因子受體（epidermic growth factor receptor，EGFR）突變的分子靶向藥物，即小分子的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs），其對存在EGFR突變的NSCLC患者具有明顯的臨床療效。繼發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變之后，棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4, EML4）與間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因EML4-ALK[2-4]和原癌基因蛋白酪氨酸激酶ROS（ROS1）被發(fā)現(xiàn)，對于存在ALK基因融合和ROS1基因融合的患者給予ALKTKI克唑替尼（crizotinib）靶向治療，可取得較好的療效。因此靶向治療前檢測EGFR、ALK和ROSl基因突變對于靶向治療療效預測和適宜患者篩選具有重要意義。

本研究通過檢測379例NSCLC患者的EGFR、ALK、ROS1基因表達情況，分析陽性患者的臨床病理特征，為篩選分子靶向治療適宜人群提供一定的數(shù)據(jù)支持。

材料與方法

1 標本及一般資料

收集我院379例手術(shù)切除經(jīng)病理確診的NSCLC患者石蠟包埋組織。其中男性250例，女性129例；年齡范圍19～87歲，中位年齡60歲，按中位年齡分2組，＜60歲：179例，≥60歲：200例。有吸煙史172例，無吸煙史207例。腺癌215例，鱗癌95例，腺鱗癌24例，其他類型45例。

2 實驗方法

2.1 DNA和RNA提取

取≥5片5μm厚度石蠟切片，置于1.5ml EP管內(nèi)。使用廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司的甲醛固定石蠟包埋樣本DNA/RNA共分離試劑盒（離心柱型）提取DNA和RNA。具體步驟按試劑盒操作說明。

2.2 EGFR、ALK和ROS1融合基因檢測

按照人類EGFR基因突變定性檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司),人類ALK/ROS1基因融合聯(lián)合檢測試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司）及人類EGFR/ALK/ROS1基因融合聯(lián)合檢測試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司）說明書提供的方法，在Mx3000P實時熒光定量PCR儀（美國Stratagene公司）中進行擴增，基因檢測位點見使用說明書。將從石蠟包埋組織中提取的RNA按照試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后連同提取的DNA一起進行實時熒光PCR。

2.3 Sanger DNA測序試驗

PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用PCR引物序列。每個樣品分別經(jīng)EGFR/ALK/ROS1的測序引物和斷裂點的上下游引物進行擴增，將擴增出的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司純化、測序。

3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果運用χ2檢驗及Fisher確切概率法，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義（雙側(cè)檢驗）。

結(jié) 果

1 非小細胞肺癌的病理學特征

HE染色顯示，肺鱗狀細胞癌腫瘤細胞排列呈實性巢狀，部分區(qū)域呈基底樣排列，細胞核增大，核染色質(zhì)粗，胞漿略豐富，可見核仁及核分裂像，局部可見不良角化（圖1A）；肺腺癌腫瘤細胞排列呈腺泡狀和腺管狀，由立方或柱狀細胞組成，核增大深染（圖1B）。免疫組織化學染色顯示，肺鱗狀細胞癌腫瘤細胞CK5/6陽性（圖1C），肺腺癌腫瘤細胞CK7陽性（圖1D）。

2 EGFR基因突變檢測結(jié)果及其與臨床病理特征的關(guān)系

379例NSCLC患者肺癌組織，EGFR突變率為36.15%（137/379），其中18外顯子突變率0.73%（1/137），19外顯子突變率39.42%（54/137），20外顯子突變率3.65%（5/137），21外顯子突變率56.20%（77/137）。其中發(fā)現(xiàn)6例兩個位點同時突變的病例，包括4例21外顯子L858R位點突變合并20外顯子T790M位點突變，2例19外顯子缺失突變合并21外顯子L858R位點突變。

在379例NSCLC患者中,女性患者EGFR突變率（56.59%，73/129）顯著高于男性患者（25.60%，64/250）；腺癌患者EGFR突變率（60.00%，129/215）顯著高于鱗癌患者（6.32%，6/95），非吸煙患者EGFR突變率（54.23%，109/201）顯著高于吸煙患者（15.73%，28/178）,年齡＜60歲患者EGFR突變率（39.11%，70/179）略高于年齡≥60歲患者（33.50%，67/200），但差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.286，P＞0.05）。

圖1 非小細胞肺癌的病理學特征。A，鱗狀細胞癌HE染色；B，腺癌HE染色；C，鱗狀細胞癌中CK5/6表達的免疫組織化學染色；D，腺癌中CK7表達的免疫組織化學染色；比例尺，100μmFig. 1 Pathological features of non-small cell lung cancer. A, HE staining of squamous cell carcinoma; B, HE staining of adenocarcinoma; C, immunohistochemical staining of CK5/6 expression in squamous cell carcinoma; D, immunohistochemical staining of CK7 expression in adenocarcinoma; scale bar, 100μm

表1 非小細胞肺癌患者EGFR/ALK/ROS1基因突變與臨床特征的相關(guān)性Tab.1 Correlation between EGFR/ALK/ROS1 gene mutations and clinical features in patients with non-small cell lung cancer

3 ALK融合基因表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

379例NSCLC患者肺癌組織，ALK融合基因陽性率3.43%（13/379），其中M1型[EML4-ALK(E13;A20)]4例、M2型[EML4-ALK(E6;A20)]3例、M3型[EML4-ALK(E20;A20)]3例、M4型[EML4-ALK(E15del60;del71A20)]1例、M6型 [EML4-ALK(E18;A20)]2例，未檢測到M5、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13和 M14 型。

379例NSCLC患者中女性患者ALK融合基因陽性率（4.65%，6/129）略高于男性患者（2.80%，7/250），但差異無顯著性（χ2=0.88，P＞0.05）；腺癌患者ALK融合基因陽性率（4.65%，10/215）略高于鱗癌患者（1.05%，1/95），但無統(tǒng)計學意義（χ2=2.493，P＞0.05）；年齡＜60歲患者ALK融合基因陽性率（4.47%，8/179）高于年齡≥60歲患者（2.50%，5/200），但兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.106，P＞0.05）；非吸煙患者ALK融合基因陽性率（4.98%，10/201）高于吸煙患者（1.69%，3/178），但差異也無顯著性（χ2=3.084，P＞0.05）。

4 ROS1融合基因檢測結(jié)果及其與臨床病理特征的關(guān)系

379例NSCLC患 者 肺 癌 組 織，ROS1融合基因陽性率3.17%（12/379），其中M8型 [CD74-ROS1(CD6;R34)]9例、M3型 [CD74-ROS1(CD6;R32)]1例（其中1例為M3和M8雙融合陽性）、M7型[SLC34A2-ROS1(SL14del;R34)]1例、M12型 [LRIG3-ROS1(LR16;R35)]1例、M14型[GOPC-ROS1(GO4;R36)]1例，未檢測到M1、M2、M4、M5、M6、M9、M10、M11 和 M13 型。

379例NSCLC患者中女性患者ROS1融合基因陽性率（5.43%，7/129）高于男性患者（2.00%，5/250），兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.258，P＞0.05）；腺癌患者ALK融合基因陽性率（2.79%，6/215）高于鱗癌患者（2.11%，2/95），兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.123，P＞0.05）；年齡＜60歲患者ALK融合基因陽性率（3.91%，7/179）高于年齡≥60歲患者（2.50%，5/200），兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.613，P＞0.05）；非吸煙患者ALK融合基因陽性率（3.98%，8/201）高于吸煙患者（2.25%，4/178），兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.925，P＞0.05）。

5 EGFR/ALK/ROS1基因融合聯(lián)合檢測

379例NSCLC患者中，對其中77例采用EGFR/ALK/ROS1基因融合聯(lián)合檢測試劑盒進行檢測，發(fā)現(xiàn)EGFR突變率為35.06%（27/77），ALK融合基因陽性率為1.30%（1/77），未檢測出ROS1融合基因。

討 論

據(jù)國家癌癥中心公布的2015年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國新發(fā)肺癌患者例數(shù)和死亡例數(shù)已居所有惡性腫瘤之首[1]。近十年來，隨著分子醫(yī)學的進展和靶向藥物的不斷發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌的治療已進入到一個個體化分子靶向精準治療的時代。隨著治療靶點EGFR的發(fā)現(xiàn)和相應靶向藥物EGFR-TKIs的問世，其后針對ALK與ROS1突變的相應的靶向藥物crizotinib也投入臨床NSCLC的靶向治療中。研究表明[2-4]，存在EGFR、ALK和ROS1基因突變的NSCLC患者可在相應的靶向治療中獲益，因此檢測EGFR、ALK和ROS1基因突變對于篩選靶向治療適宜患者具有重要的臨床意義。

EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，該區(qū)域的激活即磷酸化對癌細胞增殖、生長的相關(guān)信號傳遞具有重要意義。EGFR突變主要包括4種類型：外顯子19缺失突變、外顯子21點突變、外顯子18點突變和外顯子20插入突變，其中19外顯子缺失突變（19del）和21外顯子點突變（L858R）是最常見的對EGFR-TKI治療敏感的突變。本研究檢測379例NSCLC患者， EGFR突變也是以19外顯子和21外顯子突變?yōu)橹鳎瑫r發(fā)現(xiàn)6例兩個位點同時突變的病例，包括4例21外顯子L858R位點突變合并20外顯子T790M位點突變，2例19外顯子缺失突變合并21外顯子L858R位點突變。大量研究結(jié)果顯示[5-7]，EGFR突變的發(fā)生率在女性、非吸煙者、腺癌、亞裔人群中發(fā)生頻率較高,本研究發(fā)現(xiàn)女性、腺癌、非吸煙者的EGFR突變率明顯高于男性、鱗癌和吸煙者，且兩者差異有統(tǒng)計學意義。

2007年Rikova等[8]和Soda等[9]分別發(fā)現(xiàn)肺癌中存在EML4-ALK融合基因變異現(xiàn)象，且該基因變異具有致癌性，明確了EML4-ALK融合基因是肺癌的驅(qū)動基因之一。肺癌另一個驅(qū)動基因ROS1與ALK二者氨基酸序列上具有近49%的相似性，而在激酶催化區(qū)的ATP結(jié)合位點同源性高達77%[10]。

國內(nèi)外研究數(shù)據(jù)表明[11-13]，ALK融合基因在非小細胞肺癌患者中的陽性率為3%-7%。ROS1融合基因在非小細胞肺癌中的陽性率為1.0%-3.4%[14]，且ALK與ROS1兩個基因型的肺癌在臨床特征上也非常相似。本研究檢測結(jié)果顯示，ALK融合基因陽性率3.43%，ROS1融合基因陽性率3.17%，女性、腺癌、年齡＜60歲、非吸煙者的ALK融合基因陽性率比較高，但差異無統(tǒng)計學意義，我們認為造成不同差異的原因可能與人種選擇、研究人群的篩選及不同的檢測方法有關(guān)[15]，也與本研究中樣本量不夠大有關(guān)。

實驗數(shù)據(jù)顯示E13;A20、E6ins33;A20、E20;A20這三種融合類型的例數(shù)最多，與Sasaki等[16]研究相一致。而ROS1中CD74 exon6;ROS1 exon34融合類型最多，與國內(nèi)學者研究相一致[17]。

本實驗中有77例采用了EGFR、ALK、ROS1聯(lián)合檢測試劑盒，EGFR多基因檢測結(jié)果與單基因檢測結(jié)果基本一致，ALK、ROS1多基因檢測結(jié)果低于單基因檢測結(jié)果，可能與病例數(shù)較少有關(guān)。完成多基因聯(lián)合檢測多需的標本量與單基因檢測所需的標本量相同，同時檢測周期可縮短1天。

目前非小細胞肺癌中需要檢測靶點越來越多，為了提高檢測的有效性同時兼顧技術(shù)的可行性，專家組推薦使用經(jīng)過認證的多靶點檢測技術(shù)，對EGFR、ALK、ROS1同時檢測[18]。本研究中有77例使用了EGFR、ALK、ROS1聯(lián)合檢測試劑盒，與以往的單獨分別檢測比較既節(jié)約了組織，又提高了檢測效率、縮短了檢測時間，是一種適用于臨床的高效、經(jīng)濟、快速的NSCLC驅(qū)動基因突變檢測平臺。